廣東疫苗產(chǎn)品用宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)方法學(xué)驗(yàn)證

為什么定制化試劑盒是宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)的優(yōu)先選擇？原因之一是建立定制化檢測(cè)體系，更滿足商業(yè)化生產(chǎn)HCP工藝雜質(zhì)控制要求。在HCP校準(zhǔn)品和HCP抗體兩大關(guān)鍵試劑組分滿足要求的前提下，定制化方法的建立和優(yōu)化是基于真實(shí)純化中間品和原液樣品進(jìn)行，通過(guò)優(yōu)化檢測(cè)條件，提高對(duì)低濃度HCPs的檢測(cè)靈敏度，滿足工藝驗(yàn)證和過(guò)程控制要求。在臨床三期，生產(chǎn)工藝需要進(jìn)行系統(tǒng)驗(yàn)證，以確保其穩(wěn)定性和可重復(fù)性。定制化HCP ELISA檢測(cè)方法能夠更準(zhǔn)確地監(jiān)測(cè)生產(chǎn)工藝中HCP的去除效果，為工藝驗(yàn)證提供有力支持。在過(guò)程控制中，通過(guò)工藝特異型的HCP ELISA檢測(cè)方法，可以實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)生產(chǎn)過(guò)程中的HCP水平，具備更強(qiáng)的生產(chǎn)異常預(yù)警能力，及時(shí)發(fā)現(xiàn)生產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，確保產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定性。

影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)結(jié)果的因素之一是樣品質(zhì)量。HCP檢測(cè)貫穿生物制品生產(chǎn)的全過(guò)程，涉及收獲、純化、制備等多個(gè)步驟。在不同樣品基質(zhì)下，HCP檢測(cè)可能存在巨大差異。例如，對(duì)于含有佐劑的疫苗，由于佐劑的干擾，難以在成品中對(duì)HCP項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)，因此一般在吸附工藝之前的原液階段進(jìn)行檢測(cè)。此外樣品的收集、處理和保存方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。不正確的處理可能導(dǎo)致蛋白降解或變性，從而影響檢測(cè)結(jié)果。例如，若采用歷史批樣品作為內(nèi)部質(zhì)控品，應(yīng)結(jié)合其穩(wěn)定性數(shù)據(jù)合理制定保存條件及保存期限，以保證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

全球快速增長(zhǎng)的抗體、蛋白類藥物等生物藥由相應(yīng)工程細(xì)胞生產(chǎn)。生物制品藥物生產(chǎn)過(guò)程中的宿主內(nèi)源性蛋白，被稱為宿主細(xì)胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）會(huì)隨著不同工藝流程部分殘留在藥物中。宿主細(xì)胞殘留蛋白作為外源蛋白可能會(huì)在不同程度上引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致過(guò)敏反應(yīng)或其它不良反應(yīng)；另外還有一些殘留HCPs具有蛋白酶或脂酶的活性，可能導(dǎo)致蛋白藥物或輔料的降解，進(jìn)而增加藥物產(chǎn)品的質(zhì)量和療效的不穩(wěn)定性?；诖耍瑢?duì)藥物中HCPs的定性與定量檢測(cè)就顯得尤為重要。全球各國(guó)藥典如美國(guó)藥典，歐洲藥典以及中國(guó)藥典都對(duì)HCPs檢測(cè)提出了具體要求和標(biāo)準(zhǔn)。

宿主細(xì)胞蛋白來(lái)源中往往同時(shí)存在核酸，胞膜脂類，培養(yǎng)基中的氨基酸等非HCP成分會(huì)干擾總蛋白的檢測(cè)準(zhǔn)確性，需要在檢測(cè)之前進(jìn)行純化前處理，同時(shí)對(duì)總蛋白檢測(cè)方法進(jìn)行方法學(xué)確認(rèn)。HCP是一種多蛋白質(zhì)的混合物，總蛋白定量方法之間檢測(cè)結(jié)果會(huì)存在一定程度的差異，這也是導(dǎo)致HCP免疫檢測(cè)方法結(jié)果差異的原因之一。若HCP蛋白定量方法間檢測(cè)結(jié)果差異較大，一般同時(shí)采用2種以上經(jīng)過(guò)確認(rèn)的方法檢測(cè)，再取均值?？偟鞍讬z測(cè)方法的定量限一般只能達(dá)到μg/mL水平,但是HCP檢測(cè)試劑盒的產(chǎn)品校準(zhǔn)品在ng/mL水平。從HCP高濃度原液稀釋到低濃度產(chǎn)品校準(zhǔn)品中存在稀釋誤差，需要對(duì)產(chǎn)品校準(zhǔn)品進(jìn)行重新標(biāo)定賦值。

按照美國(guó)藥典1132章節(jié)的要求，HCPs校準(zhǔn)品需滿足代表性要求，即能覆蓋實(shí)際工藝產(chǎn)品生產(chǎn)中的HCPs。從HCP免疫檢測(cè)方法使用目的和預(yù)期風(fēng)險(xiǎn)管理要求考慮，滿足工藝開發(fā)和驗(yàn)證，同時(shí)為了應(yīng)對(duì)下游工藝中潛在的異常工藝失效，或工藝變更需求，建議采用上游發(fā)酵工藝末端，如澄清處理后工藝點(diǎn)的樣本作為HCPs的來(lái)源。在實(shí)際制備中，可采用空細(xì)胞或空載細(xì)胞在模擬實(shí)際工藝的預(yù)定條件進(jìn)行采集，通過(guò)二維電泳或高分辨率質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行模擬工藝和實(shí)際工藝下HCPs的代表性表征分析。越靠近下游HCPs蛋白種類越少，也越接近DS中HCPs，但是其可能無(wú)法滿足工藝開發(fā)和驗(yàn)證需求，也無(wú)法保證工藝的潛在風(fēng)險(xiǎn)，往往不推薦使用，或只作為上游工藝HCPs免疫檢測(cè)法的輔助使用。

目前通過(guò)Vero細(xì)胞培養(yǎng)的病毒有狂犬病病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒等，種類繁多，工藝也各有千秋。湖州申科生物Vero細(xì)胞裂解型HCP殘留檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）針對(duì)工藝過(guò)程中Vero細(xì)胞裂解后產(chǎn)生的大量不同種類的HCPs，可定量檢測(cè)使用Vero細(xì)胞系生產(chǎn)并通過(guò)細(xì)胞裂解工藝收獲的生物制品中宿主細(xì)胞蛋白的殘留檢測(cè)，抗體與校準(zhǔn)品可覆蓋近3000種蛋白。試劑盒操作簡(jiǎn)便，提高實(shí)驗(yàn)人員的時(shí)間利用率。試劑盒抗體覆蓋率為65.1%-85.1%（IMBS-2D）和76.9%(IMBS-MS，Unique Peptide≥2）。試劑盒嚴(yán)格遵循ISO13485質(zhì)量體系進(jìn)行生產(chǎn)，并按照法規(guī)要求進(jìn)行了性能驗(yàn)證，各項(xiàng)性能滿足Vero宿主細(xì)胞蛋白檢測(cè)需求。