CHO-K1宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測性能驗證
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發(fā)布時間:2025-08-28
湖州申科生物結(jié)合不同宿主實際的生產(chǎn)工藝,通過高質(zhì)量免疫原和 HCP 多抗的標(biāo)準(zhǔn)化制備流程,獲得高效價、高覆蓋率的抗體,開發(fā)了適用于大腸桿菌表達(dá)菌 (BL21) 生產(chǎn)工藝、克隆菌堿裂法提取質(zhì)粒工藝的 SHENTEK®E.coli HCP檢測試劑盒, 適用于CHO\MDCK\HEK293\Sf9\VERO\畢赤酵母等不同宿主的 HCP 檢測試劑盒。用于中間品、原液及終產(chǎn)品等的HCP定量監(jiān)測。為確保 ELISA 對HCP定量檢測的準(zhǔn)確性,須對 HCP 抗體覆蓋率進(jìn)行驗證。湖州申科抗體覆蓋率平臺采用2D Clean-up 試劑盒去除蛋白樣品的干擾物(洗滌劑、鹽、脂質(zhì)、酚類和核酸等離子污染物),并設(shè)置2D 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行嚴(yán)格質(zhì)控,同時以陰性抗體為對照平行試驗,以提高結(jié)果準(zhǔn)確度。
湖州申科自主研發(fā)IMBS抗體覆蓋率檢測法及低豐度HCP富集技術(shù),合作完成多項課題并發(fā)表成果。CHO-K1宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測性能驗證
按照美國藥典1132章節(jié)的要求,HCPs校準(zhǔn)品需滿足代表性要求,即能覆蓋實際工藝產(chǎn)品生產(chǎn)中的HCPs。從HCP免疫檢測方法使用目的和預(yù)期風(fēng)險管理要求考慮,滿足工藝開發(fā)和驗證,同時為了應(yīng)對下游工藝中潛在的異常工藝失效,或工藝變更需求,建議采用上游發(fā)酵工藝末端,如澄清處理后工藝點的樣本作為HCPs的來源。在實際制備中,可采用空細(xì)胞或空載細(xì)胞在模擬實際工藝的預(yù)定條件進(jìn)行采集,通過二維電泳或高分辨率質(zhì)譜等蛋白質(zhì)組學(xué)方法進(jìn)行模擬工藝和實際工藝下HCPs的代表性表征分析。越靠近下游HCPs蛋白種類越少,也越接近DS中HCPs,但是其可能無法滿足工藝開發(fā)和驗證需求,也無法保證工藝的潛在風(fēng)險,往往不推薦使用,或只作為上游工藝HCPs免疫檢測法的輔助使用。
北京E.coli表達(dá)菌宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測常見問題分析HCP具有異質(zhì)性,體現(xiàn)在分子本身的多樣性以及和工藝相關(guān)的變異性。
為了更好地控制工藝和保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定,各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)均要求提供使用的宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測ELISA試劑盒的抗體覆蓋率數(shù)據(jù)。一般需進(jìn)行覆蓋率分析的場景一般有以下幾種情況:①臨床II期后,若是繼續(xù)使用商品化試劑盒,則需要評估試劑盒抗體覆蓋率是否可以繼續(xù)用于質(zhì)量監(jiān)控;②臨床III期及以后階段,產(chǎn)品研究者開發(fā)了平臺化或工藝專屬型的HCP監(jiān)測方法,該類試劑盒在使用前要評估覆蓋率水平與商業(yè)化覆蓋水平的差異;③申報時沒有提交覆蓋率數(shù)據(jù),監(jiān)管機(jī)構(gòu)可能會對企業(yè)提出發(fā)補(bǔ)的要求;④產(chǎn)品上市后發(fā)生了包括生產(chǎn)場地變更,工藝變更,HCP分析方法變更等因素的變更,研究者則需要評估變更前后抗體覆蓋率水平的差異,以及該差異對藥品質(zhì)量與安全帶來的影響。
影響宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測結(jié)果的因素之一是操作規(guī)范。一方面,實驗人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗對檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性有很大影響。熟練的實驗人員能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行樣品處理、試劑配制和儀器操作,減少人為誤差。另一方面,一個合理的HCP檢測方法,在開發(fā)及應(yīng)用時,應(yīng)當(dāng)考慮操作的合理變動區(qū)間(即耐用性)并設(shè)置相質(zhì)控,從程序上盡量消除人為誤差對結(jié)果的影響。此外,嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作流程(SOP)是確保檢測結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。操作步驟的不規(guī)范可能導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性差或誤差增大。目前,湖州申科已正式推出全自動化HCP ELISA檢測系統(tǒng),可以完成從樣品制備、孵育、洗板至數(shù)據(jù)采集等一系列操作,結(jié)合實驗室信息管理系統(tǒng)(LIMS),可以實現(xiàn)“輸入即輸出”,減少流程誤差。
湖州申科生物目前已承接常見宿主類型的HCP定制化開發(fā),如期交付率達(dá)到100%。
宿主細(xì)胞蛋白來源中往往同時存在核酸,胞膜脂類,培養(yǎng)基中的氨基酸等非HCP成分會干擾總蛋白的檢測準(zhǔn)確性,需要在檢測之前進(jìn)行純化前處理,同時對總蛋白檢測方法進(jìn)行方法學(xué)確認(rèn)。HCP是一種多蛋白質(zhì)的混合物,總蛋白定量方法之間檢測結(jié)果會存在一定程度的差異,這也是導(dǎo)致HCP免疫檢測方法結(jié)果差異的原因之一。若HCP蛋白定量方法間檢測結(jié)果差異較大,一般同時采用2種以上經(jīng)過確認(rèn)的方法檢測,再取均值??偟鞍讬z測方法的定量限一般只能達(dá)到μg/mL水平,但是HCP檢測試劑盒的產(chǎn)品校準(zhǔn)品在ng/mL水平。從HCP高濃度原液稀釋到低濃度產(chǎn)品校準(zhǔn)品中存在稀釋誤差,需要對產(chǎn)品校準(zhǔn)品進(jìn)行重新標(biāo)定賦值。
工藝特異型、平臺型、通用型HCP檢測試劑盒各有特點,滿足不同需求。北京E.coli表達(dá)菌宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測常見問題分析
樣品與抗體的匹配程度對宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測的結(jié)果影響很大。CHO-K1宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測性能驗證
湖州申科生物致力于開發(fā)接近實際工藝的商業(yè)化宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測試劑盒,通過不同工藝的HCP差異化分析,針對性輸出不同細(xì)分工藝領(lǐng)域的HCP檢測試劑盒。實驗數(shù)據(jù)表明:針對CHO-S與CHO-K1兩種宿主細(xì)胞,二者共享2458種共同HCP(占比79.7%),但分別存在392種與236種特異HCP,凸顯工藝差異導(dǎo)致的殘留蛋白特異性。進(jìn)一步對比B3表達(dá)菌與K2克隆菌,二者雖共享1489種相同蛋白(占比88%和85%),但仍分別檢出208種和258種獨有蛋白,差異率達(dá)12%-15%。這些發(fā)現(xiàn)直接驗證不同工藝路線與克隆選擇會影響HCP殘留譜的組成。因此,湖州申科提出"工藝定制化檢測"策略——通過準(zhǔn)確識別共性及特異HCP,針對性開發(fā)細(xì)分試劑盒產(chǎn)品。
CHO-K1宿主細(xì)胞蛋白(HCP)殘留檢測性能驗證