廣東生物制品宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測方法對比

磷脂酶B樣蛋白2（Phospholipase B-Like 2，PLBL2/PLBD2），因其強共純化能力、強免疫原性和潛在的酶活性，被認為是CHO HCP的關鍵高風險因子之一。目前行業(yè)建議，需要開發(fā)特定的檢測方法對這些已知蛋白或特定蛋白進行監(jiān)控以更好地把控其潛在風險。SHENTEK^® CHO PLBL-2殘留檢測試劑盒（酶聯(lián)免疫吸附法）是湖州申科生物自主研發(fā)的、具有完全自主知識產(chǎn)權的CHO PLBL-2蛋白通用檢測試劑盒。本試劑盒適用于基于CHO表達系統(tǒng)的生物制品中CHO HCP高風險蛋白PLBL-2的定量檢測。本試劑盒操作步驟少，快速，檢測專一性強，性能穩(wěn)定可靠。

湖州申科生物結合不同宿主實際的生產(chǎn)工藝，通過高質量免疫原和 HCP 多抗的標準化制備流程，獲得高效價、高覆蓋率的抗體，開發(fā)了適用于大腸桿菌表達菌 (BL21) 生產(chǎn)工藝、克隆菌堿裂法提取質粒工藝的 SHENTEK®E.coli HCP檢測試劑盒， 適用于CHO\MDCK\HEK293\Sf9\VERO\畢赤酵母等不同宿主的 HCP 檢測試劑盒。用于中間品、原液及終產(chǎn)品等的HCP定量監(jiān)測。為確保 ELISA 對HCP定量檢測的準確性，須對 HCP 抗體覆蓋率進行驗證。湖州申科抗體覆蓋率平臺采用2D Clean-up 試劑盒去除蛋白樣品的干擾物（洗滌劑、鹽、脂質、酚類和核酸等離子污染物），并設置2D 質控標準品進行嚴格質控，同時以陰性抗體為對照平行試驗，以提高結果準確度。

宿主細胞蛋白（HCP）ELISA定制化開發(fā)平臺需要具備完善的開發(fā)體系，可靠的技術平臺，專業(yè)的開發(fā)團隊，以實現(xiàn)長期穩(wěn)定供應符合法規(guī)要求的試劑盒。其中校準品作為關鍵原材料，其良好的穩(wěn)定性和溯源保障對生命周期至關重要。為確保校準品的穩(wěn)定，一般采用凍干工藝制備校準品，用單因素方差分析方法對校準品進行均一性評估，采用法規(guī)規(guī)定的蛋白定量方法進行校準品的賦值，并溯源至國家標準品（如有）或BSA國家標準品。其次，由于HCPs是復雜的多分析物，為制備盡可能高覆蓋率的抗體，覆蓋工藝下特有的高風險HCPs，需采用可靠的免疫策略。得到符合性能要求的抗體后，需采用經(jīng)過驗證的可靠的2D或LC-MS方法進行抗體覆蓋率的表征，以確?？贵w可以充分覆蓋各實際工藝下產(chǎn)生的HCPs。得到了具有代表性的抗原和性能優(yōu)良的抗體后，便是ELISA檢測體系的開發(fā)，主要包括原輔料的篩選和制備研究、各組分工藝及反應體系研究、穩(wěn)定性研究等。在檢測體系開發(fā)完成后，需要根據(jù)ICH及藥典要求進行分析方法驗證的評估，以確保整個檢測體系的線性、范圍、檢測限、定量限、準確度、精密度、專屬性以及耐用性等可以滿足法規(guī)要求。

影響宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測結果的因素之一是操作規(guī)范。一方面，實驗人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗對檢測結果的準確性有很大影響。熟練的實驗人員能夠準確地進行樣品處理、試劑配制和儀器操作，減少人為誤差。另一方面，一個合理的HCP檢測方法，在開發(fā)及應用時，應當考慮操作的合理變動區(qū)間（即耐用性）并設置相質控，從程序上盡量消除人為誤差對結果的影響。此外，嚴格遵循標準操作流程（SOP）是確保檢測結果可靠性的關鍵。操作步驟的不規(guī)范可能導致結果的重復性差或誤差增大。目前，湖州申科已正式推出全自動化HCP ELISA檢測系統(tǒng)，可以完成從樣品制備、孵育、洗板至數(shù)據(jù)采集等一系列操作，結合實驗室信息管理系統(tǒng)（LIMS），可以實現(xiàn)“輸入即輸出”，減少流程誤差。

中國倉鼠卵巢細胞（Chinese Hamster Ovary，CHO）是抗體、重組蛋白、疫苗等生物制品生產(chǎn)中普遍使用的動物細胞表達系統(tǒng)。在使用CHO宿主生產(chǎn)過程中，不可避免的會引入宿主細胞蛋白（HCP）雜質，即使較低殘留水平下，HCPs也會存在免疫原性，降低產(chǎn)品蛋白穩(wěn)定性等的風險。因此需對生物制品中殘留的HCP進行定量分析，以保證純化工藝的一致性和終產(chǎn)品的安全性。SHENTEK^®CHO HCP檢測試劑盒實現(xiàn)關鍵試劑全國產(chǎn)化，采用CHO 細胞（K1&S）補料分批培養(yǎng)工藝制備HCPs 免疫綿羊，獲得專門的抗體，用于CHO細胞系表達的生物制品(單抗，重組蛋白，疫苗等)中宿主細胞蛋白的殘留檢測。本試劑盒操作步驟少、快速、檢測專一性強、性能穩(wěn)定可靠。

宿主細胞殘留蛋白（HCP）檢測是生物制品質量控制的關鍵環(huán)節(jié)，采用基于抗體的免疫學方法（如ELISA）。然而，不同試劑盒之間的檢測結果常存在明顯差異，關鍵原因在于其依賴的關鍵組分——HCP校準品和檢測抗體——本身制備與表征的高度可變性。校準品作為定量的基準，其復雜性極大。不同供應商在制備時使用的細胞來源、培養(yǎng)及表達條件、宿主蛋白提取純化工藝（例如目標產(chǎn)物去除策略）差異明顯，導致校準品的組成、代表性及穩(wěn)定性各不相同。同樣，檢測抗體（尤其是多抗）通過免疫動物獲得，其特異性與覆蓋度受免疫原、動物應答個體差異、免疫方案及后續(xù)抗體篩選/純化過程的影響巨大，不同批次或來源抗體的識別譜（如對不同HCP的親和力、對低豐度蛋白的靈敏度）存在本質差別。正是這些關鍵組分固有的明顯變異度，導致不同試劑盒對同一樣本的檢測結果在數(shù)值上、甚至特定HCP的檢出能力上可能出現(xiàn)較大偏差。因此，為確保檢測結果真實反映自身產(chǎn)品的HCP殘留情況，企業(yè)應結合自身產(chǎn)品特性和工藝，對不同試劑盒進行詳細的平行比對與適用性評估，以篩選出匹配度較高的檢測方案。