廣東ELISA法宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)試劑盒開發(fā)要求

HCP是由宿主細(xì)胞（通常是哺乳動(dòng)物細(xì)胞或微生物）產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)具有潛在的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)影響藥物的安全性和有效性。因此，HCP殘留量是生物藥物中一個(gè)關(guān)鍵質(zhì)量屬性，要求在藥物的開發(fā)和生產(chǎn)階段對(duì)HCP的存在進(jìn)行嚴(yán)格的監(jiān)控、管理和記錄。隨著生產(chǎn)流程，生物制品的純度在逐漸提高，HCPs總量和種類卻在持續(xù)降低，這使得對(duì)HCP的分析和監(jiān)測(cè)工作變得更加具有挑戰(zhàn)性。在這種情況下，開發(fā)高效的HCP富集材料和技術(shù)變得尤為關(guān)鍵。低豐度宿主殘留蛋白富集試劑盒，專為生物制品（如單抗、融合蛋白等）中HCP的富集和去除高豐度蛋白而設(shè)計(jì)，利用磁珠法構(gòu)建了一個(gè)多樣化且復(fù)雜的親和配體庫，旨在高效地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白。其設(shè)計(jì)不僅針對(duì)傳統(tǒng)的單一蛋白，還能適用于融合蛋白、單克隆抗體等多種生物樣本類型，展現(xiàn)了較強(qiáng)的適用性和靈活性。

全球快速增長的抗體、蛋白類藥物等生物藥由相應(yīng)工程細(xì)胞生產(chǎn)。生物制品藥物生產(chǎn)過程中的宿主內(nèi)源性蛋白，被稱為宿主細(xì)胞蛋白（Host Cell Proteins, HCPs）會(huì)隨著不同工藝流程部分殘留在藥物中。宿主細(xì)胞殘留蛋白作為外源蛋白可能會(huì)在不同程度上引發(fā)機(jī)體的免疫應(yīng)答，導(dǎo)致過敏反應(yīng)或其它不良反應(yīng)；另外還有一些殘留HCPs具有蛋白酶或脂酶的活性，可能導(dǎo)致蛋白藥物或輔料的降解，進(jìn)而增加藥物產(chǎn)品的質(zhì)量和療效的不穩(wěn)定性。基于此，對(duì)藥物中HCPs的定性與定量檢測(cè)就顯得尤為重要。全球各國藥典如美國藥典，歐洲藥典以及中國藥典都對(duì)HCPs檢測(cè)提出了具體要求和標(biāo)準(zhǔn)。

畢赤酵母（Pichia pastoris）是第二代酵母表達(dá)系統(tǒng)中的代表性菌株，是美國FDA認(rèn)定的GRAS（Generally Recognized As Safe）微生物，具有表達(dá)水平高，產(chǎn)物活性好，培養(yǎng)成本低，易擴(kuò)大為工業(yè)化生產(chǎn)等特點(diǎn)。在生物制藥領(lǐng)域，酶制劑、胰島素、表皮生長因子、膠原蛋白等多種生物制劑已經(jīng)通過畢赤酵母系統(tǒng)進(jìn)行商業(yè)化生產(chǎn)。與其他產(chǎn)品雜質(zhì)一樣，畢赤酵母宿主殘留蛋白（HCP）可能對(duì)生物制品的安全性和有效性產(chǎn)生不利影響，因此在生產(chǎn)監(jiān)測(cè)、產(chǎn)品放行等過程中需要對(duì)其進(jìn)行定量研究并進(jìn)行嚴(yán)格控制。SHENTEK^®畢赤酵母HCP殘留檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）是湖州申科生物自主研發(fā)、具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、實(shí)現(xiàn)關(guān)鍵試劑全國產(chǎn)化的畢赤酵母HCP通用檢測(cè)試劑盒。本試劑盒適用于基于GS115、X33等在內(nèi)的畢赤酵母菌株生產(chǎn)的生物制品中宿主殘留蛋白的定量檢測(cè)，操作步驟少、快速，檢測(cè)專一性強(qiáng)，性能穩(wěn)定可靠。

湖州申科生物致力于提供符合嚴(yán)格法規(guī)要求的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA檢測(cè)試劑盒。為確保產(chǎn)品滿足生物制品（如抗體藥、疫苗）申報(bào)（如IND/BLA）的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，申科構(gòu)建了全流程依規(guī)開發(fā)的質(zhì)量體系：整個(gè)開發(fā)過程嚴(yán)格遵循ISO 13485質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并滿足用戶審計(jì)要求。其開發(fā)流程明確包含三個(gè)關(guān)鍵階段：①HCP殘留定量檢測(cè)參考品開發(fā)：關(guān)鍵在于建立可靠的HCP抗原參考品，涵蓋抗原的表征、量值溯源與賦值、均一性和穩(wěn)定性考察等，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性與代表性。②高質(zhì)量大批量抗體制備：通過優(yōu)化的HCP抗原動(dòng)物免疫策略，結(jié)合嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目贵w質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（如建立標(biāo)準(zhǔn)、覆蓋率驗(yàn)證）和穩(wěn)定的制備工藝，生產(chǎn)具有高特異性和廣覆蓋度的檢測(cè)抗體，保證檢測(cè)的特異性和靈敏度。③檢測(cè)體系開發(fā)及驗(yàn)證：進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測(cè)體系開發(fā)與驗(yàn)證工作，其驗(yàn)證方案符合ICH指導(dǎo)原則及藥典關(guān)于分析方法驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)要求。同時(shí)，嚴(yán)格執(zhí)行物料質(zhì)控，并在潔凈車間環(huán)境中進(jìn)行生產(chǎn)，確保試劑盒方法的穩(wěn)健性、重現(xiàn)性與法規(guī)符合性。這一從抗原源頭到成品體系的標(biāo)準(zhǔn)化、合規(guī)化開發(fā)流程，是湖州申科HCP檢測(cè)產(chǎn)品品質(zhì)與可靠性的根本保障。

影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)結(jié)果的因素之一是樣品質(zhì)量。HCP檢測(cè)貫穿生物制品生產(chǎn)的全過程，涉及收獲、純化、制備等多個(gè)步驟。在不同樣品基質(zhì)下，HCP檢測(cè)可能存在巨大差異。例如，對(duì)于含有佐劑的疫苗，由于佐劑的干擾，難以在成品中對(duì)HCP項(xiàng)目進(jìn)行檢測(cè)，因此一般在吸附工藝之前的原液階段進(jìn)行檢測(cè)。此外樣品的收集、處理和保存方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果至關(guān)重要。不正確的處理可能導(dǎo)致蛋白降解或變性，從而影響檢測(cè)結(jié)果。例如，若采用歷史批樣品作為內(nèi)部質(zhì)控品，應(yīng)結(jié)合其穩(wěn)定性數(shù)據(jù)合理制定保存條件及保存期限，以保證檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)抗體覆蓋率評(píng)估實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，需要在建立實(shí)驗(yàn)方法階段對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分的驗(yàn)證，以證明實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)健性。湖州申科開發(fā)的基于磁珠捕獲的IMBS方法（immunomagnetic beads separation），在開發(fā)過程中對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行了充分驗(yàn)證,相關(guān)結(jié)果經(jīng)過專業(yè)評(píng)審，驗(yàn)證的內(nèi)容如下（部分）：①方法優(yōu)化：針對(duì)磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證，以保證方法的穩(wěn)健性；②過程質(zhì)控：二維電泳存在實(shí)驗(yàn)步驟多，時(shí)間跨度長，中間步驟難以控制等缺陷，因此在等電聚焦實(shí)驗(yàn)部分設(shè)計(jì)了熒光標(biāo)記多肽，可快速判斷等電聚焦效果。在SDS-PAGE電泳的兩側(cè)增加40 ng銀染質(zhì)控，用于銀染顯色的控制；③方法重復(fù)性：針對(duì)2D分析以及LC-MS分析進(jìn)行重復(fù)性確認(rèn)，其中2D分析方法重復(fù)性可達(dá)到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上；④上樣量優(yōu)化：針對(duì)2D分析以及LC-MS分析進(jìn)行上樣量確認(rèn)，消除上樣量差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來的影響；⑤假陽性：排除樣品與陰性抗體之間是否存在非特異性結(jié)合，確定IMBS實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的步驟、參數(shù)是否有假陽性結(jié)果存在。