江蘇生物制品宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)免疫策略

湖州申科生物致力于提供符合嚴(yán)格法規(guī)要求的宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA檢測(cè)試劑盒。為確保產(chǎn)品滿足生物制品（如抗體藥、疫苗）申報(bào)（如IND/BLA）的監(jiān)管標(biāo)準(zhǔn)，申科構(gòu)建了全流程依規(guī)開(kāi)發(fā)的質(zhì)量體系：整個(gè)開(kāi)發(fā)過(guò)程嚴(yán)格遵循ISO 13485質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并滿足用戶審計(jì)要求。其開(kāi)發(fā)流程明確包含三個(gè)關(guān)鍵階段：①HCP殘留定量檢測(cè)參考品開(kāi)發(fā)：關(guān)鍵在于建立可靠的HCP抗原參考品，涵蓋抗原的表征、量值溯源與賦值、均一性和穩(wěn)定性考察等，確保檢測(cè)的準(zhǔn)確性與代表性。②高質(zhì)量大批量抗體制備：通過(guò)優(yōu)化的HCP抗原動(dòng)物免疫策略，結(jié)合嚴(yán)謹(jǐn)?shù)目贵w質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)（如建立標(biāo)準(zhǔn)、覆蓋率驗(yàn)證）和穩(wěn)定的制備工藝，生產(chǎn)具有高特異性和廣覆蓋度的檢測(cè)抗體，保證檢測(cè)的特異性和靈敏度。③檢測(cè)體系開(kāi)發(fā)及驗(yàn)證：進(jìn)行嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臋z測(cè)體系開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證工作，其驗(yàn)證方案符合ICH指導(dǎo)原則及藥典關(guān)于分析方法驗(yàn)證的標(biāo)準(zhǔn)要求。同時(shí)，嚴(yán)格執(zhí)行物料質(zhì)控，并在潔凈車間環(huán)境中進(jìn)行生產(chǎn)，確保試劑盒方法的穩(wěn)健性、重現(xiàn)性與法規(guī)符合性。這一從抗原源頭到成品體系的標(biāo)準(zhǔn)化、合規(guī)化開(kāi)發(fā)流程，是湖州申科HCP檢測(cè)產(chǎn)品品質(zhì)與可靠性的根本保障。

影響宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)結(jié)果的因素之一是操作規(guī)范。一方面，實(shí)驗(yàn)人員的專業(yè)技能和經(jīng)驗(yàn)對(duì)檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有很大影響。熟練的實(shí)驗(yàn)人員能夠準(zhǔn)確地進(jìn)行樣品處理、試劑配制和儀器操作，減少人為誤差。另一方面，一個(gè)合理的HCP檢測(cè)方法，在開(kāi)發(fā)及應(yīng)用時(shí)，應(yīng)當(dāng)考慮操作的合理變動(dòng)區(qū)間（即耐用性）并設(shè)置相質(zhì)控，從程序上盡量消除人為誤差對(duì)結(jié)果的影響。此外，嚴(yán)格遵循標(biāo)準(zhǔn)操作流程（SOP）是確保檢測(cè)結(jié)果可靠性的關(guān)鍵。操作步驟的不規(guī)范可能導(dǎo)致結(jié)果的重復(fù)性差或誤差增大。目前，湖州申科已正式推出全自動(dòng)化HCP ELISA檢測(cè)系統(tǒng)，可以完成從樣品制備、孵育、洗板至數(shù)據(jù)采集等一系列操作，結(jié)合實(shí)驗(yàn)室信息管理系統(tǒng)（LIMS），可以實(shí)現(xiàn)“輸入即輸出”，減少流程誤差。

大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli)又稱大腸桿菌，其作為模式微生物被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。隨著基因治療產(chǎn)業(yè)的大力發(fā)展，大腸桿菌也被主要應(yīng)用于質(zhì)粒DNA（pDNA）的生產(chǎn)。由于質(zhì)粒樣品的常見(jiàn)提取工藝中往往使用條件劇烈的堿溶液進(jìn)行細(xì)胞裂解和蛋白質(zhì)變性，使得其中的HCPs與傳統(tǒng)物理破碎法獲得的HCPs有較大的差異，導(dǎo)致其在采用免疫學(xué)原理的檢測(cè)方法時(shí)，殘留檢測(cè)結(jié)果差別較大。湖州申科生物E.coli克隆菌堿裂HCP殘留檢測(cè)試劑盒用于大腸桿菌（又名大腸埃希菌）克隆菌株相關(guān)的HCPs檢測(cè)，如DH5α、Top10、JM109等。在抗體制備時(shí)采用堿裂工藝制備的HCPs免疫動(dòng)物，獲得專門的抗體。適用于經(jīng)堿液裂解工藝處理后的宿主細(xì)胞蛋白HCPs定量檢測(cè)。

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)抗體覆蓋率評(píng)估實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，需要在建立實(shí)驗(yàn)方法階段對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分的驗(yàn)證，以證明實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)健性。湖州申科開(kāi)發(fā)的基于磁珠捕獲的IMBS方法（immunomagnetic beads separation），在開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行了充分驗(yàn)證,相關(guān)結(jié)果經(jīng)過(guò)專業(yè)評(píng)審，驗(yàn)證的內(nèi)容如下（部分）：①方法優(yōu)化：針對(duì)磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證，以保證方法的穩(wěn)健性；②過(guò)程質(zhì)控：二維電泳存在實(shí)驗(yàn)步驟多，時(shí)間跨度長(zhǎng)，中間步驟難以控制等缺陷，因此在等電聚焦實(shí)驗(yàn)部分設(shè)計(jì)了熒光標(biāo)記多肽，可快速判斷等電聚焦效果。在SDS-PAGE電泳的兩側(cè)增加40 ng銀染質(zhì)控，用于銀染顯色的控制；③方法重復(fù)性：針對(duì)2D分析以及LC-MS分析進(jìn)行重復(fù)性確認(rèn)，其中2D分析方法重復(fù)性可達(dá)到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上；④上樣量?jī)?yōu)化：針對(duì)2D分析以及LC-MS分析進(jìn)行上樣量確認(rèn)，消除上樣量差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來(lái)的影響；⑤假陽(yáng)性：排除樣品與陰性抗體之間是否存在非特異性結(jié)合，確定IMBS實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的步驟、參數(shù)是否有假陽(yáng)性結(jié)果存在。

為什么定制化試劑盒是宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)的優(yōu)先選擇？這與檢測(cè)準(zhǔn)確性和藥物安全性密切相關(guān)。HCP ELISA 檢測(cè)作為多分析物檢測(cè)方法，其結(jié)果準(zhǔn)確性高度依賴校準(zhǔn)品、抗體質(zhì)量及檢測(cè)方法建立。定制化 HCP ELISA 檢測(cè)試劑盒的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于，它基于更具代表性的 HCP 抗原免疫動(dòng)物，由此產(chǎn)生的 HCP 抗體針對(duì)性更強(qiáng)。這種針對(duì)性抗體能極大降低 HCP 漏檢風(fēng)險(xiǎn)，尤其對(duì)生產(chǎn)工藝中特有的高風(fēng)險(xiǎn) HCP 因子，展現(xiàn)出更優(yōu)的檢出效果，為藥物的安全有效和質(zhì)量可控提供有力保障。

在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的分析方法中， ELISA方法是廣泛應(yīng)用的，并作為QC日常放行檢測(cè)的主要手段。ELISA方法相對(duì)簡(jiǎn)單、精度良好，方便設(shè)定控制范圍和建立技術(shù)規(guī)范，適用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和過(guò)程控制；但ELISA方法檢測(cè)依靠抗原抗體特異性結(jié)合，因此用存在于生物制品中的HCPs作為免疫原生產(chǎn)出的抗體質(zhì)量至關(guān)重要。無(wú)論是商品化ELISA試劑盒，還是自制的多克隆抗體，如果抗體的特異性和適用性不夠高，都有可能帶來(lái)HCPs漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)生物制品質(zhì)量安全帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，ELISA檢測(cè)HCPs使用多克隆抗體，無(wú)法針對(duì)性的提供高風(fēng)險(xiǎn)HCPs殘留蛋白真實(shí)存在情況。