江蘇ELISA法宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)常見(jiàn)問(wèn)題分析

湖州申科生物推出的宿主細(xì)胞殘留蛋白檢測(cè)全自動(dòng) ELISA 分析系統(tǒng)，整合了標(biāo)曲制備、樣本加樣、恒溫孵育、板孔清洗及結(jié)果檢測(cè)等全流程功能。系統(tǒng)搭載的高精度前處理模塊與檢測(cè)模塊，通準(zhǔn)確控制實(shí)驗(yàn)參數(shù)，有效減少人為操作誤差，確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的穩(wěn)定性與準(zhǔn)確性。其多模塊單獨(dú)運(yùn)行設(shè)計(jì)，可實(shí)現(xiàn)不同檢測(cè)任務(wù)的并行處理，大幅縮短實(shí)驗(yàn)周期，明顯提升整體實(shí)驗(yàn)效率。在保障結(jié)果可靠的基礎(chǔ)上，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了 ELISA 實(shí)驗(yàn)的自動(dòng)化操作、標(biāo)準(zhǔn)化流程與快速化輸出，降低了對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的技能要求，同時(shí)通過(guò)優(yōu)化資源配置減少檢測(cè)成本。此外，系統(tǒng)內(nèi)置完善的數(shù)據(jù)管理功能，可滿(mǎn)足實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)完整性記錄與全流程審計(jì)追蹤需求，嚴(yán)格符合 21 CFR Part 11 法規(guī)要求，并配備三級(jí)權(quán)限管理機(jī)制，進(jìn)一步保障實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的安全性與規(guī)范性。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA定制化開(kāi)發(fā)平臺(tái)需要具備完善的開(kāi)發(fā)體系，可靠的技術(shù)平臺(tái)，專(zhuān)業(yè)的開(kāi)發(fā)團(tuán)隊(duì)，以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)符合法規(guī)要求的試劑盒。其中校準(zhǔn)品作為關(guān)鍵原材料，其良好的穩(wěn)定性和溯源保障對(duì)生命周期至關(guān)重要。為確保校準(zhǔn)品的穩(wěn)定，一般采用凍干工藝制備校準(zhǔn)品，用單因素方差分析方法對(duì)校準(zhǔn)品進(jìn)行均一性評(píng)估，采用法規(guī)規(guī)定的蛋白定量方法進(jìn)行校準(zhǔn)品的賦值，并溯源至國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）或BSA國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)品。其次，由于HCPs是復(fù)雜的多分析物，為制備盡可能高覆蓋率的抗體，覆蓋工藝下特有的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs，需采用可靠的免疫策略。得到符合性能要求的抗體后，需采用經(jīng)過(guò)驗(yàn)證的可靠的2D或LC-MS方法進(jìn)行抗體覆蓋率的表征，以確?？贵w可以充分覆蓋各實(shí)際工藝下產(chǎn)生的HCPs。得到了具有代表性的抗原和性能優(yōu)良的抗體后，便是ELISA檢測(cè)體系的開(kāi)發(fā)，主要包括原輔料的篩選和制備研究、各組分工藝及反應(yīng)體系研究、穩(wěn)定性研究等。在檢測(cè)體系開(kāi)發(fā)完成后，需要根據(jù)ICH及藥典要求進(jìn)行分析方法驗(yàn)證的評(píng)估，以確保整個(gè)檢測(cè)體系的線(xiàn)性、范圍、檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、專(zhuān)屬性以及耐用性等可以滿(mǎn)足法規(guī)要求。

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)抗體覆蓋率評(píng)估：法規(guī)推薦的方法有兩大類(lèi)：一類(lèi)是傳統(tǒng)2D-WB法，另一類(lèi)是基于抗體親和的免疫捕獲類(lèi)方法。傳統(tǒng)2D-WB法存在需要蛋白變性，樣品需要前處理（破壞蛋白天然表位）；轉(zhuǎn)膜效率低；易產(chǎn)生非特異性等缺陷，難以反映真實(shí)的覆蓋率水平。湖州申科自主開(kāi)發(fā)了免疫磁珠捕獲分離技術(shù)（immunomagnetic beads separation，IMBS)，利用免疫磁珠的半液態(tài)性質(zhì)，可以在懸浮的條件下與HCP樣本充分混勻結(jié)合，整個(gè)過(guò)程蛋白無(wú)需變性，結(jié)合方式與ELISA檢測(cè)條件相似，可以獲得更真實(shí)的覆蓋率結(jié)果。

宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCP）檢測(cè)是生物制品質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用基于抗體的免疫學(xué)方法（如ELISA）。然而，不同試劑盒之間的檢測(cè)結(jié)果常存在明顯差異，關(guān)鍵原因在于其依賴(lài)的關(guān)鍵組分——HCP校準(zhǔn)品和檢測(cè)抗體——本身制備與表征的高度可變性。校準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)，其復(fù)雜性極大。不同供應(yīng)商在制備時(shí)使用的細(xì)胞來(lái)源、培養(yǎng)及表達(dá)條件、宿主蛋白提取純化工藝（例如目標(biāo)產(chǎn)物去除策略）差異明顯，導(dǎo)致校準(zhǔn)品的組成、代表性及穩(wěn)定性各不相同。同樣，檢測(cè)抗體（尤其是多抗）通過(guò)免疫動(dòng)物獲得，其特異性與覆蓋度受免疫原、動(dòng)物應(yīng)答個(gè)體差異、免疫方案及后續(xù)抗體篩選/純化過(guò)程的影響巨大，不同批次或來(lái)源抗體的識(shí)別譜（如對(duì)不同HCP的親和力、對(duì)低豐度蛋白的靈敏度）存在本質(zhì)差別。正是這些關(guān)鍵組分固有的明顯變異度，導(dǎo)致不同試劑盒對(duì)同一樣本的檢測(cè)結(jié)果在數(shù)值上、甚至特定HCP的檢出能力上可能出現(xiàn)較大偏差。因此，為確保檢測(cè)結(jié)果真實(shí)反映自身產(chǎn)品的HCP殘留情況，企業(yè)應(yīng)結(jié)合自身產(chǎn)品特性和工藝，對(duì)不同試劑盒進(jìn)行詳細(xì)的平行比對(duì)與適用性評(píng)估，以篩選出匹配度較高的檢測(cè)方案。

湖州申科生物致力于開(kāi)發(fā)接近實(shí)際工藝的商業(yè)化宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)試劑盒，通過(guò)不同工藝的HCP差異化分析，針對(duì)性輸出不同細(xì)分工藝領(lǐng)域的HCP檢測(cè)試劑盒。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：針對(duì)CHO-S與CHO-K1兩種宿主細(xì)胞，二者共享2458種共同HCP（占比79.7%），但分別存在392種與236種特異HCP，凸顯工藝差異導(dǎo)致的殘留蛋白特異性。進(jìn)一步對(duì)比B3表達(dá)菌與K2克隆菌，二者雖共享1489種相同蛋白（占比88%和85%），但仍分別檢出208種和258種獨(dú)有蛋白，差異率達(dá)12%-15%。這些發(fā)現(xiàn)直接驗(yàn)證不同工藝路線(xiàn)與克隆選擇會(huì)影響HCP殘留譜的組成。因此，湖州申科提出"工藝定制化檢測(cè)"策略——通過(guò)準(zhǔn)確識(shí)別共性及特異HCP，針對(duì)性開(kāi)發(fā)細(xì)分試劑盒產(chǎn)品。

在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的分析方法中， ELISA方法是廣泛應(yīng)用的，并作為QC日常放行檢測(cè)的主要手段。ELISA方法相對(duì)簡(jiǎn)單、精度良好，方便設(shè)定控制范圍和建立技術(shù)規(guī)范，適用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和過(guò)程控制；但ELISA方法檢測(cè)依靠抗原抗體特異性結(jié)合，因此用存在于生物制品中的HCPs作為免疫原生產(chǎn)出的抗體質(zhì)量至關(guān)重要。無(wú)論是商品化ELISA試劑盒，還是自制的多克隆抗體，如果抗體的特異性和適用性不夠高，都有可能帶來(lái)HCPs漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)生物制品質(zhì)量安全帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，ELISA檢測(cè)HCPs使用多克隆抗體，無(wú)法針對(duì)性的提供高風(fēng)險(xiǎn)HCPs殘留蛋白真實(shí)存在情況。