江蘇生物制品宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)試劑盒

宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)抗體覆蓋率評(píng)估實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜，需要在建立實(shí)驗(yàn)方法階段對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行充分的驗(yàn)證，以證明實(shí)驗(yàn)方法的穩(wěn)健性。湖州申科開發(fā)的基于磁珠捕獲的IMBS方法（immunomagnetic beads separation），在開發(fā)過程中對(duì)關(guān)鍵步驟進(jìn)行了充分驗(yàn)證,相關(guān)結(jié)果經(jīng)過專業(yè)評(píng)審，驗(yàn)證的內(nèi)容如下（部分）：①方法優(yōu)化：針對(duì)磁珠與抗體的偶聯(lián)比例、洗滌液體積、洗滌次數(shù)、洗脫次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化驗(yàn)證，以保證方法的穩(wěn)健性；②過程質(zhì)控：二維電泳存在實(shí)驗(yàn)步驟多，時(shí)間跨度長(zhǎng)，中間步驟難以控制等缺陷，因此在等電聚焦實(shí)驗(yàn)部分設(shè)計(jì)了熒光標(biāo)記多肽，可快速判斷等電聚焦效果。在SDS-PAGE電泳的兩側(cè)增加40 ng銀染質(zhì)控，用于銀染顯色的控制；③方法重復(fù)性：針對(duì)2D分析以及LC-MS分析進(jìn)行重復(fù)性確認(rèn)，其中2D分析方法重復(fù)性可達(dá)到80%以上，LC-MS分析方法可到90%以上；④上樣量?jī)?yōu)化：針對(duì)2D分析以及LC-MS分析進(jìn)行上樣量確認(rèn)，消除上樣量差異對(duì)檢測(cè)結(jié)果帶來的影響；⑤假陽性：排除樣品與陰性抗體之間是否存在非特異性結(jié)合，確定IMBS實(shí)驗(yàn)所設(shè)定的步驟、參數(shù)是否有假陽性結(jié)果存在。

宿主細(xì)胞蛋白通常是與重要細(xì)胞功能相關(guān)的蛋白，如細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡等，在工藝過程中分泌或因細(xì)胞死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過程中，以下幾個(gè)因素會(huì)主要影響HCP的組成和豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在的HCP數(shù)量可能非常大，且非所有基因都表達(dá)，某些基因在不同的時(shí)間和條件下表達(dá)；如大腸桿菌約4300個(gè)基因，不同的工藝產(chǎn)物會(huì)經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，增加了HCP的總數(shù)和生化復(fù)雜性。有研究表明，如大腸桿菌表達(dá)的蛋白，其不同蛋白之間存在數(shù)量差異，這些差異可能是對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但大多數(shù) (85-90%) 有潛在免疫原性的宿主細(xì)胞蛋白在不同的發(fā)酵過程中都會(huì)出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體和輔助成分組成的體系可以穩(wěn)定、瞬時(shí)和誘導(dǎo)表達(dá)；如大腸桿菌常見的表達(dá)形式有胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性的包涵體形式，以及融合和非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品本身的特性的影響：純化過程中大部分的HCP被去除(>99％)，殘留的HCP仍保留在產(chǎn)品中，可能與產(chǎn)品共結(jié)合，一起被純化。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）作為生物制品中來源于細(xì)胞基質(zhì)的殘留雜質(zhì)，具有明顯的異質(zhì)性特征。其復(fù)雜性體現(xiàn)在三個(gè)方面：①理化特性差異：HCP涵蓋胞內(nèi)及分泌蛋白，涉及關(guān)鍵生理功能，具有涵蓋區(qū)間大的等電點(diǎn)（pI 3-11）、分子量范圍（5-250kDa）及疏水性；②上游工藝影響：不同發(fā)酵工藝（如細(xì)胞株、培養(yǎng)條件）誘導(dǎo)獨(dú)特的翻譯后修飾（PTM），導(dǎo)致HCP總量與生化復(fù)雜性增加；③下游工藝與產(chǎn)物特性干擾：抗體、細(xì)胞因子等重組蛋白或病毒類藥物的純化工藝會(huì)選擇性殘留特定HCP，且產(chǎn)物形式（如大腸桿菌的包涵體/可溶性表達(dá)）直接影響HCP殘留譜。針對(duì)特定生產(chǎn)工藝開發(fā)定制化檢測(cè)方案是準(zhǔn)確監(jiān)控宿主細(xì)胞蛋白殘留的關(guān)鍵。

宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA定制化開發(fā)平臺(tái)需要具備完善的開發(fā)體系，可靠的技術(shù)平臺(tái)，專業(yè)的開發(fā)團(tuán)隊(duì)，以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)符合法規(guī)要求的試劑盒。其中校準(zhǔn)品作為關(guān)鍵原材料，其良好的穩(wěn)定性和溯源保障對(duì)生命周期至關(guān)重要。為確保校準(zhǔn)品的穩(wěn)定，一般采用凍干工藝制備校準(zhǔn)品，用單因素方差分析方法對(duì)校準(zhǔn)品進(jìn)行均一性評(píng)估，采用法規(guī)規(guī)定的蛋白定量方法進(jìn)行校準(zhǔn)品的賦值，并溯源至國家標(biāo)準(zhǔn)品（如有）或BSA國家標(biāo)準(zhǔn)品。其次，由于HCPs是復(fù)雜的多分析物，為制備盡可能高覆蓋率的抗體，覆蓋工藝下特有的高風(fēng)險(xiǎn)HCPs，需采用可靠的免疫策略。得到符合性能要求的抗體后，需采用經(jīng)過驗(yàn)證的可靠的2D或LC-MS方法進(jìn)行抗體覆蓋率的表征，以確?？贵w可以充分覆蓋各實(shí)際工藝下產(chǎn)生的HCPs。得到了具有代表性的抗原和性能優(yōu)良的抗體后，便是ELISA檢測(cè)體系的開發(fā)，主要包括原輔料的篩選和制備研究、各組分工藝及反應(yīng)體系研究、穩(wěn)定性研究等。在檢測(cè)體系開發(fā)完成后，需要根據(jù)ICH及藥典要求進(jìn)行分析方法驗(yàn)證的評(píng)估，以確保整個(gè)檢測(cè)體系的線性、范圍、檢測(cè)限、定量限、準(zhǔn)確度、精密度、專屬性以及耐用性等可以滿足法規(guī)要求。

為了更好地控制工藝和保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)均要求提供使用的宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)ELISA試劑盒的抗體覆蓋率數(shù)據(jù)。一般需進(jìn)行覆蓋率分析的場(chǎng)景一般有以下幾種情況：①臨床II期后，若是繼續(xù)使用商品化試劑盒，則需要評(píng)估試劑盒抗體覆蓋率是否可以繼續(xù)用于質(zhì)量監(jiān)控；②臨床III期及以后階段，產(chǎn)品研究者開發(fā)了平臺(tái)化或工藝專屬型的HCP監(jiān)測(cè)方法，該類試劑盒在使用前要評(píng)估覆蓋率水平與商業(yè)化覆蓋水平的差異；③申報(bào)時(shí)沒有提交覆蓋率數(shù)據(jù)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)可能會(huì)對(duì)企業(yè)提出發(fā)補(bǔ)的要求；④產(chǎn)品上市后發(fā)生了包括生產(chǎn)場(chǎng)地變更，工藝變更，HCP分析方法變更等因素的變更，研究者則需要評(píng)估變更前后抗體覆蓋率水平的差異，以及該差異對(duì)藥品質(zhì)量與安全帶來的影響。

湖州申科生物通過自主可控的供應(yīng)鏈體系與嚴(yán)格驗(yàn)證的技術(shù)性能，確保HCP檢測(cè)試劑盒的長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)與優(yōu)異的分析能力。一方面，公司實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵物料的自研自產(chǎn)：校準(zhǔn)品采用凍干工藝大規(guī)模制備，可穩(wěn)定保存10年以上；抗體通過大動(dòng)物免疫獲得，產(chǎn)量可滿足≥10,000盒試劑盒的生產(chǎn)需求，保障同批次抗體持續(xù)供應(yīng)超過10年；試劑盒經(jīng)多批次驗(yàn)證顯示良好的批內(nèi)與批間一致性。另一方面，所有產(chǎn)品參考ICH Q2（R2）和ICH M10法規(guī)要求完成驗(yàn)證：以E.coli HCP產(chǎn)品為例，其線性范圍（243-1 ng/mL）的R2>0.999，各濃度點(diǎn)回收率偏差≤5%；準(zhǔn)確度達(dá)81.2%-111.6%，中間精密度CV值5.7%-12.4%；LLOQ低至1.5 ng/mL，且對(duì)多種宿主細(xì)胞（如CHO、HEK293等）的交叉反應(yīng)均低于檢測(cè)限。同時(shí)，通過二維電泳（檢出826個(gè)蛋白點(diǎn)）與質(zhì)譜法（鑒定2204個(gè)蛋白點(diǎn)）雙重表征校準(zhǔn)品，并采用IMBS-2D（>70%）與IMBS-MS（84.7%）正交技術(shù)驗(yàn)證抗體覆蓋率，從源頭確保檢測(cè)結(jié)果的全面性與可靠性。