浙江重組蛋白用宿主細胞蛋白（HCP）殘留檢測抗體覆蓋率驗證

湖州申科采用免疫磁珠分離（IMBS）結(jié)合 2D 電泳或者 LC-MS 的方法評估抗體覆蓋率。IMBS主要流程包括多克隆抗體與磁珠偶聯(lián)，磁珠未結(jié)合位點的封閉，HCP樣本與結(jié)合抗體的磁珠共同孵育，此過程中 HCP 抗體結(jié)合可以識別的 HCP，而未識別的 HCP 則通過后續(xù)洗滌步驟去除，再通過低 pH等洗脫條件收集抗體捕獲的HCP。該方法擁有 AAE(Antibody Affinity Extraction)免疫層析柱分離的所有優(yōu)點，同時免疫磁珠可以在懸浮的條件下與 HCP樣品充分混勻結(jié)合，HCP結(jié)合效果更佳，由于采用磁珠吸附可以減少 HCP與填料的非特異性吸附，提高實驗準(zhǔn)確性。

湖州申科在宿主細胞蛋白（HCP）ELISA檢測技術(shù)領(lǐng)域擁有深厚的積累，已成功構(gòu)建高質(zhì)量、全流程的自有開發(fā)平臺，覆蓋HCP檢測試劑盒研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①抗原表征與制備：基于合規(guī)平臺的HCP Reference/Antigen制備能力，采用2D凝膠電泳等先進技術(shù)確?？乖瓗斓拇硇浴＂趧游锩庖吲c抗體制備：依托自有免疫動物平臺，控制免疫原設(shè)計與動物免疫過程，產(chǎn)出高特異性、廣覆蓋度的抗體。③體系開發(fā)與驗證：憑借成熟的技術(shù)經(jīng)驗開發(fā)高靈敏度、高穩(wěn)定性的檢測體系，并嚴格遵循GMP標(biāo)準(zhǔn)完成方法學(xué)驗證。該平臺通過全流程自主可控的技術(shù)整合，從源頭保證試劑盒性能的一致性與可靠性，明顯降低不同批次試劑盒的檢測變異性。其研發(fā)的HCP ELISA試劑盒已成功服務(wù)于國內(nèi)外200余家生物醫(yī)藥企業(yè)，為生物制品（如單抗、疫苗）的工藝開發(fā)、質(zhì)量控制及法規(guī)申報（如IND/BLA）提供符合監(jiān)管要求的定制化檢測解決方案。

宿主細胞殘留蛋白（HCP）檢測是生物制品質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用基于抗體的免疫學(xué)方法（如ELISA）。然而，不同試劑盒之間的檢測結(jié)果常存在明顯差異，關(guān)鍵原因在于其依賴的關(guān)鍵組分——HCP校準(zhǔn)品和檢測抗體——本身制備與表征的高度可變性。校準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)，其復(fù)雜性極大。不同供應(yīng)商在制備時使用的細胞來源、培養(yǎng)及表達條件、宿主蛋白提取純化工藝（例如目標(biāo)產(chǎn)物去除策略）差異明顯，導(dǎo)致校準(zhǔn)品的組成、代表性及穩(wěn)定性各不相同。同樣，檢測抗體（尤其是多抗）通過免疫動物獲得，其特異性與覆蓋度受免疫原、動物應(yīng)答個體差異、免疫方案及后續(xù)抗體篩選/純化過程的影響巨大，不同批次或來源抗體的識別譜（如對不同HCP的親和力、對低豐度蛋白的靈敏度）存在本質(zhì)差別。正是這些關(guān)鍵組分固有的明顯變異度，導(dǎo)致不同試劑盒對同一樣本的檢測結(jié)果在數(shù)值上、甚至特定HCP的檢出能力上可能出現(xiàn)較大偏差。因此，為確保檢測結(jié)果真實反映自身產(chǎn)品的HCP殘留情況，企業(yè)應(yīng)結(jié)合自身產(chǎn)品特性和工藝，對不同試劑盒進行詳細的平行比對與適用性評估，以篩選出匹配度較高的檢測方案。

昆蟲細胞桿狀病毒表達系統(tǒng)（IC-BEVS）是以桿狀病毒作為外源基因載體，以昆蟲細胞作為宿主進行外源蛋白生產(chǎn)的真核表達系統(tǒng)。BVES具有易于規(guī)模化生產(chǎn)、培養(yǎng)成本低、生物安全性高等優(yōu)勢，近年來陸續(xù)被研究用于生產(chǎn)重組蛋白、rAAV載體、亞單位疫苗（如病毒樣顆粒（VLP）疫苗）等， 在生物制品重組蛋白表達領(lǐng)域已有普遍運用。Sf9來源于草地夜蛾細胞系（Spodoptera frugiperda cell line，Sf），是目前較常用的昆蟲細胞系之一。SHENTEK® Sf9 HCP殘留蛋白檢測試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法），可定量檢測使用Sf9細胞系生產(chǎn)的生物制品中宿主細胞蛋白的殘留檢測。試劑盒抗體覆蓋率為70.4%-96.0%（IMBS-2D）和91.2% (IMBS-MS，Unique Peptide ≥2）。

為了更好地控制工藝和保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，各國監(jiān)管機構(gòu)均要求提供使用的宿主細胞蛋白殘留檢測ELISA試劑盒的抗體覆蓋率數(shù)據(jù)。一般需進行覆蓋率分析的場景一般有以下幾種情況：①臨床II期后，若是繼續(xù)使用商品化試劑盒，則需要評估試劑盒抗體覆蓋率是否可以繼續(xù)用于質(zhì)量監(jiān)控；②臨床III期及以后階段，產(chǎn)品研究者開發(fā)了平臺化或工藝專屬型的HCP監(jiān)測方法，該類試劑盒在使用前要評估覆蓋率水平與商業(yè)化覆蓋水平的差異；③申報時沒有提交覆蓋率數(shù)據(jù)，監(jiān)管機構(gòu)可能會對企業(yè)提出發(fā)補的要求；④產(chǎn)品上市后發(fā)生了包括生產(chǎn)場地變更，工藝變更，HCP分析方法變更等因素的變更，研究者則需要評估變更前后抗體覆蓋率水平的差異，以及該差異對藥品質(zhì)量與安全帶來的影響。

對于HCP抗體的純化方法，目前美國藥典1132章節(jié)推薦有兩種方式，包括protein A或protein G親和柱層析法和HCP抗原親和柱層析法。兩種方法各有優(yōu)缺點，均符合監(jiān)管的要求。在實際使用過程中，這對不同產(chǎn)品可能會導(dǎo)致檢測結(jié)果的差異。兩者方法得到的抗體主要區(qū)別是HCP抗體有效含量的占比。HCP抗原親和柱層析法顯然占比高，但是也存在某些HCP抗體丟失的情況，這也會導(dǎo)致針對某些樣本的檢測結(jié)果比前者偏低，需要企業(yè)在實際方法建立時進行充分的評估。HCP抗原親和柱層析法對純化工藝要求更高，為保證抗體批間一致性，需要重點考察HCP抗原柱制備工藝、柱子的使用壽命、再制備的一致性等問題。