使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設(shè)計(jì)核酸酶進(jìn)行基因組編輯，可以將遺傳物質(zhì)定向?qū)氩溉閯?dòng)物基因組的特定位點(diǎn)。然而，可能會(huì)出現(xiàn)非預(yù)期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并破壞正?；虻墓δ埽瑥亩赡軐?dǎo)致臨床前和臨床研究中的安全問(wèn)題?；蚓庉嬆壳暗拿摪蟹治黾夹g(shù)主要依賴(lài)于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)。這些預(yù)測(cè)缺乏可靠性，因?yàn)樗鼈冎缓w了潛在基因組改變的一小部分。而頻率低于0.5%的脫靶突變大多無(wú)法被全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到。我們是開(kāi)發(fā)用于全基因組靶向/非靶向分析的無(wú)偏分析的先驅(qū)。靶向基因組編輯唯可生物為基因編輯安全性評(píng)估提供多方面的PCR和基于NGS的分析。我...

CRISPR/Cas9的問(wèn)題：和TALEN和ZFNS技術(shù)一樣，CRISPR/Cas9技術(shù)在應(yīng)用時(shí)也存在一定概率的脫靶問(wèn)題——Cas9核酸酶在非目標(biāo)位點(diǎn)發(fā)生切割，引入非預(yù)期的基因突變。脫靶切割引入的突變可能會(huì)直接破壞細(xì)胞的基本功能，帶來(lái)不可預(yù)控的嚴(yán)重后果。如何減輕脫靶效應(yīng)？gRNA的GC含量：gRNA 的序列結(jié)構(gòu)對(duì)CRISPR/Cas9基因編輯的靶向活性有影響。gRNA 序列中 40%–60%的 GC 含量可以增加靶向活性，因?yàn)檩^高的 GC 含量穩(wěn)定了DNA：RNA 雙鏈體并破壞了脫靶結(jié)合。gRNA-on-gRNA序列的位置對(duì)編輯有影響，位于四個(gè)核苷酸末端的嘌呤殘基可以提高編輯效率。鳥(niǎo)嘌呤優(yōu)先選...

由于設(shè)計(jì)的sgRNA會(huì)與非靶點(diǎn)DNA序列錯(cuò)配，引入非預(yù)期的基因突變，即脫靶效應(yīng)(Off-targeteffects)。脫靶效應(yīng)造成了研究中的許多不確定性，這無(wú)疑限制了該技術(shù)的應(yīng)用。因此，研究者希望能開(kāi)發(fā)有效的方法來(lái)檢測(cè)脫靶效應(yīng)。在目前主流的脫靶效應(yīng)評(píng)估方法中，有一種方法為GUIDE-seq，其原理是利用一種短的雙鏈寡聚核苷酸（dsODN）標(biāo)記CRISPR/Cas誘導(dǎo)的脫靶斷裂，然后對(duì)標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域進(jìn)行高通量測(cè)序，通過(guò)生物信息學(xué)分析從而確定脫靶位點(diǎn)。利用該技術(shù)可以在基因組范圍內(nèi)檢測(cè)CRISPR脫靶效應(yīng)，從而改變了以往先預(yù)測(cè)假定脫靶位點(diǎn)再檢測(cè)的思路；與其他的評(píng)估方法相比，GUIDE-seq更...

gRNA的長(zhǎng)度和錯(cuò)配： 17個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的gRNA顯示出更高的基因組編輯效率。相比之下，18-20 bp的長(zhǎng)度顯示出較低的基因組編輯效率。在人類(lèi)細(xì)胞中減少潛在脫靶效應(yīng)的指導(dǎo)方針：1) 應(yīng)避免在PAM的7-10 bp范圍內(nèi)靶序列有超過(guò)3個(gè)錯(cuò)配；2) 在PAM的12 bp內(nèi)，應(yīng)避免sgRNA 凸起以減少脫靶效應(yīng)。gRNA的化學(xué)修飾：在gRNA核糖磷酸骨架中加入2?-O-甲基-3?-膦酰基乙酸酯會(huì)導(dǎo)致位點(diǎn)特異性修飾，使脫靶切割減少40-120倍，同時(shí)保持靶向性能。gRNA上游5'發(fā)夾結(jié)構(gòu)的修飾可以提高Cas9和Cas12的特異性，降低脫靶效應(yīng)。種子基因脫靶檢測(cè)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢...

細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會(huì)改變其生物學(xué)特性，同時(shí)也會(huì)帶來(lái)新的安全性風(fēng)險(xiǎn)，如基因編輯脫靶風(fēng)險(xiǎn)、載體插入突變風(fēng)險(xiǎn)、載體重組風(fēng)險(xiǎn)、表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)等。細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會(huì)改變其生物學(xué)特性，同時(shí)也會(huì)帶來(lái)新的安全性風(fēng)險(xiǎn)，如基因編輯脫靶風(fēng)險(xiǎn)、載體插入突變風(fēng)險(xiǎn)、載體重組風(fēng)險(xiǎn)、表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)等?；诨蛐揎椉?xì)胞的產(chǎn)品種類(lèi)繁多、各有特點(diǎn)，除上述一般技術(shù)要求外，還應(yīng)基于產(chǎn)品的性進(jìn)行相應(yīng)的特殊考慮。本指導(dǎo)原則列舉了以下三種情形的特殊考慮。可以與靶基因之外的其他基因作用而非特異性阻斷基因表達(dá),即產(chǎn)生非靶基因的沉默效應(yīng)。常州育種脫靶檢測(cè)安評(píng)堿基編輯器：CBE：胞嘧啶堿基編輯器(Cytosine base edito...

圍繞大家關(guān)心的CRISPR基因編輯安全性問(wèn)題，我們首先對(duì)CRISPR脫靶位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行一次大盤(pán)點(diǎn)，在sgRNA設(shè)計(jì)階段需要如何做才能夠盡可能地避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。較簡(jiǎn)單的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法是全基因組測(cè)序（WGS），但在實(shí)際使用中，即使測(cè)序深度達(dá)到100X，也很難發(fā)現(xiàn)一些低頻率的脫靶位點(diǎn)，同時(shí)測(cè)序成本卻非常高。為彌補(bǔ)WGS的這些缺陷，常見(jiàn)的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)都需要對(duì)脫靶位點(diǎn)進(jìn)行捕獲富集，來(lái)提高檢測(cè)靈敏度，降低測(cè)序成本。按照實(shí)驗(yàn)原理的不同，脫靶位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)可以分為細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和其他特殊方法這3類(lèi)。脫靶檢測(cè)安全性評(píng)價(jià)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。深圳脫靶檢測(cè)企業(yè)細(xì)胞...

細(xì)胞外檢測(cè)方法：細(xì)胞外檢測(cè)方法較為直接，將基因組提純后進(jìn)行CRISPR體外切割實(shí)驗(yàn)，再捕獲發(fā)生脫靶切割的位點(diǎn)即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類(lèi)細(xì)胞外脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的全基因組測(cè)序流程獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，之后需要較為復(fù)雜的生物信息學(xué)分析才能夠獲得CRISPR切割位點(diǎn)的信息?？傮w來(lái)講，這種方法測(cè)序成本較高，并且檢測(cè)靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測(cè)到低頻脫靶位點(diǎn)，一般需要在建庫(kù)時(shí)定向捕獲CRISPR切割位點(diǎn)。SITE-seq就是這樣一種測(cè)序方法，提純的基因組DNA經(jīng)過(guò)Cas9/sgRNA切割...

細(xì)胞外檢測(cè)方法：細(xì)胞外檢測(cè)方法較為直接，將基因組提純后進(jìn)行CRISPR體外切割實(shí)驗(yàn)，再捕獲發(fā)生脫靶切割的位點(diǎn)即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類(lèi)細(xì)胞外脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經(jīng)過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的全基因組測(cè)序流程獲得測(cè)序數(shù)據(jù)，之后需要較為復(fù)雜的生物信息學(xué)分析才能夠獲得CRISPR切割位點(diǎn)的信息?？傮w來(lái)講，這種方法測(cè)序成本較高，并且檢測(cè)靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測(cè)到低頻脫靶位點(diǎn)，一般需要在建庫(kù)時(shí)定向捕獲CRISPR切割位點(diǎn)。SITE-seq就是這樣一種測(cè)序方法，提純的基因組DNA經(jīng)過(guò)Cas9/sgRNA切割...

基因編輯產(chǎn)品除了適用基因zhiliao產(chǎn)品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長(zhǎng)期隨訪中還應(yīng)額外關(guān)注脫靶風(fēng)險(xiǎn)，量化評(píng)估脫靶活性和在靶活性之間的相關(guān)性，或利用在靶活性來(lái)預(yù)測(cè)脫靶活性的水平。在開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)同時(shí)關(guān)注基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在靶細(xì)胞中整合位點(diǎn)及表達(dá)。評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性，判斷是否需要開(kāi)展另外的遺傳毒性研究，評(píng)估插入突變（插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等）引起的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問(wèn)題；鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。非臨床研究是藥物開(kāi)發(fā)的重要環(huán)節(jié)之一。脫靶檢測(cè)guide-sequence，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)...

圍繞大家關(guān)心的CRISPR基因編輯安全性問(wèn)題，我們首先對(duì)CRISPR脫靶位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行一次大盤(pán)點(diǎn)，在sgRNA設(shè)計(jì)階段需要如何做才能夠盡可能地避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。較簡(jiǎn)單的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)方法是全基因組測(cè)序（WGS），但在實(shí)際使用中，即使測(cè)序深度達(dá)到100X，也很難發(fā)現(xiàn)一些低頻率的脫靶位點(diǎn)，同時(shí)測(cè)序成本卻非常高。為彌補(bǔ)WGS的這些缺陷，常見(jiàn)的脫靶位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)都需要對(duì)脫靶位點(diǎn)進(jìn)行捕獲富集，來(lái)提高檢測(cè)靈敏度，降低測(cè)序成本。按照實(shí)驗(yàn)原理的不同，脫靶位點(diǎn)檢測(cè)技術(shù)可以分為細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和其他特殊方法這3類(lèi)。如何檢測(cè)是否發(fā)生脫靶？武漢off-target脫靶檢測(cè)CRO細(xì)胞外檢測(cè)方法：細(xì)胞外檢測(cè)方法較為直接，將...

GUIDE-Seq脫靶評(píng)估技術(shù)的優(yōu)勢(shì)分析鼓潤(rùn)致力于基因組編輯工具脫靶的分析檢測(cè)工作，為篩選、優(yōu)化基因組編輯工具的保真性提供標(biāo)準(zhǔn)化的分析。我們脫靶分析具有如下優(yōu)勢(shì)：實(shí)用性強(qiáng)：能反映CRISPR在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯的在靶與脫靶情況，以進(jìn)行安全性和有效性評(píng)價(jià)；檢測(cè)通量高：一次能檢測(cè)多個(gè)樣本的在靶與脫靶情況，并通過(guò)優(yōu)化的標(biāo)簽設(shè)計(jì)，降低實(shí)際的測(cè)序reads數(shù)量；準(zhǔn)確性高：絕大部分檢測(cè)結(jié)果可被驗(yàn)證；靈敏度高：能夠高效檢測(cè)出低頻脫靶位點(diǎn)，檢測(cè)低至0.1%的脫靶突變；實(shí)驗(yàn)難度低：操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行細(xì)胞適應(yīng)性強(qiáng)。脫靶檢測(cè)安評(píng)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。深圳脫靶檢測(cè)guide...

持續(xù)ganran，有復(fù)制能力的病毒或細(xì)菌載體基因zhiliao產(chǎn)品，有可能在免疫能力低下的患者中發(fā)展為持續(xù)ganran，進(jìn)一步增加發(fā)生遲發(fā)但嚴(yán)重ganran的風(fēng)險(xiǎn)?；蚓庉嫽钚?，基因編輯等新型基因zhiliao產(chǎn)品有獨(dú)特的基因組修飾功能，可誘導(dǎo)人類(lèi)基因組中的位點(diǎn)特異性改變或修飾，同時(shí)也可能在基因組中發(fā)生脫靶效應(yīng)，導(dǎo)致非預(yù)期的基因表達(dá)變化，進(jìn)而增加未知且不可預(yù)測(cè)的遲發(fā)性不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。非預(yù)期的生物分布，某些基因zhiliao產(chǎn)品需要在特定的細(xì)胞或組織中表達(dá)以實(shí)現(xiàn)zhiliao目的，如果基因zhiliao產(chǎn)品在非預(yù)期的細(xì)胞、組織或qiguan中表達(dá)或修飾，可能引起非靶細(xì)胞功能、生長(zhǎng)或/分化改變，甚至...

不同基因zhiliao產(chǎn)品的特殊考慮。關(guān)于整合性載體的特殊考慮如受試者接受整合性載體基因zhiliao產(chǎn)品，例如轉(zhuǎn)座子元件、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或利用整合性載體或基于轉(zhuǎn)座子的載體在體外修飾的細(xì)胞，長(zhǎng)期隨訪中需格外關(guān)注基因zhiliao產(chǎn)品的基因組整合風(fēng)險(xiǎn)，建議申辦方分析基因zhiliao載體在靶細(xì)胞或相關(guān)替代細(xì)胞的基因組中整合的影響（例如是否存在克隆性生長(zhǎng)、是否存在優(yōu)勢(shì)克隆、克隆性生長(zhǎng)是否導(dǎo)致惡性liu等）。如果基因組整合相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的分析可行，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：?在接受基因zhiliao產(chǎn)品的較初5年內(nèi)，兩次檢測(cè)間的采樣間隔建議不超過(guò)6個(gè)月。此后每年至少檢測(cè)一次，直至檢測(cè)數(shù)...

使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設(shè)計(jì)核酸酶進(jìn)行基因組編輯，可以將遺傳物質(zhì)定向?qū)氩溉閯?dòng)物基因組的特定位點(diǎn)。然而，可能會(huì)出現(xiàn)非預(yù)期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并破壞正常基因的功能，從而可能導(dǎo)致臨床前和臨床研究中的安全問(wèn)題?；蚓庉嬆壳暗拿摪蟹治黾夹g(shù)主要依賴(lài)于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)。這些預(yù)測(cè)缺乏可靠性，因?yàn)樗鼈冎缓w了潛在基因組改變的一小部分。而頻率低于0.5%的脫靶突變大多無(wú)法被全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到。我們是開(kāi)發(fā)用于全基因組靶向/非靶向分析的無(wú)偏分析的先驅(qū)。靶向基因組編輯唯可生物為基因編輯安全性評(píng)估提供多方面的PCR和基于NGS的分析。我...

采用基因編輯技術(shù)制備的細(xì)胞產(chǎn)品。對(duì)于采用基因編輯技術(shù)制備的基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)進(jìn)行體外在靶和脫靶活性評(píng)估，以確認(rèn)修飾酶或向?qū)NA對(duì)靶基因序列的特異性。在評(píng)估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)說(shuō)明所選擇的評(píng)價(jià)策略的合理性和敏感性。雖然采用計(jì)算機(jī)分析預(yù)測(cè)基因編輯的潛在脫靶位點(diǎn)，并對(duì)潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行深度測(cè)序分析，可用于評(píng)估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)；但選擇的評(píng)價(jià)策略仍應(yīng)包含體外全基因組測(cè)序比對(duì)，以證明潛在脫靶位點(diǎn)未出現(xiàn)脫靶。此外，在評(píng)估脫靶活性時(shí)，還應(yīng)評(píng)估種屬特異性的差異、細(xì)胞病理生理狀態(tài)的差異或細(xì)胞類(lèi)型的差異對(duì)非臨床數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)性的影響。必要時(shí)，還應(yīng)分析基因編輯對(duì)細(xì)胞表型和生理功能的潛在影響。育種脫靶檢測(cè)，推薦唯可生...

基因重排或重組。當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品所用載體及其攜帶的基因發(fā)生復(fù)制時(shí)，可能出現(xiàn)非zhiliao目的非預(yù)期的基因表達(dá)或改變，或者與相應(yīng)野生型或輔助病毒互補(bǔ)后產(chǎn)生回復(fù)突變或意外復(fù)制或形成6新的病毒。免疫原性。由于基因zhiliao產(chǎn)品在體內(nèi)的持續(xù)暴露或者需要多次給藥等情況，機(jī)體可能產(chǎn)生針對(duì)基因zhiliao載體或編碼的作用因子的免疫應(yīng)答。由于基因zhiliao產(chǎn)品在靶細(xì)胞或組織中的表達(dá)時(shí)間、分布范圍或表達(dá)強(qiáng)度等差異，機(jī)體免疫應(yīng)答的后果可能從不具有臨床意義的一過(guò)性的免疫反應(yīng)，到針對(duì)靶細(xì)胞或組織的免疫攻擊，甚至產(chǎn)生嚴(yán)重危及生命的不良事件。檢測(cè)脫靶效應(yīng)比較好的方法:CIRCLE-seq。臺(tái)州基因編輯...

以上長(zhǎng)期隨訪時(shí)間的建議主要基于基因zhiliao的產(chǎn)品類(lèi)型，具體產(chǎn)品的隨訪時(shí)間取決于產(chǎn)品的特性和體內(nèi)存在時(shí)間、轉(zhuǎn)基因表達(dá)時(shí)間、遲發(fā)性不良反應(yīng)的預(yù)期時(shí)間及發(fā)生率、受試者適應(yīng)癥和預(yù)期生存期、給藥途徑、以及長(zhǎng)期隨訪的其他觀察目的。隨著隨訪數(shù)據(jù)的積累，研究者和研究申辦方可能會(huì)根據(jù)產(chǎn)品的存在情況、轉(zhuǎn)基因表達(dá)和臨床表現(xiàn)的持續(xù)評(píng)估情況，延長(zhǎng)或縮短長(zhǎng)期隨訪的持續(xù)時(shí)間。如果研究申辦方認(rèn)為其基因zhiliao產(chǎn)品安全性風(fēng)險(xiǎn)較低、無(wú)需開(kāi)展長(zhǎng)期隨訪臨床研究，或者希望變更隨訪時(shí)間，應(yīng)合理說(shuō)明依據(jù)或變更理由并與藥品監(jiān)督管理部門(mén)進(jìn)行溝通。如何檢測(cè)是否發(fā)生脫靶? 基因編輯的脫靶率檢測(cè)一般有兩種方法。臺(tái)州crispr/cas9...

BLESS：利用生物素標(biāo)簽對(duì)DSBs進(jìn)行原位標(biāo)記，后經(jīng)PCR擴(kuò)增實(shí)現(xiàn)對(duì)于生物素標(biāo)記片段的富集，并通過(guò)二代測(cè)序?qū)崿F(xiàn)脫靶位點(diǎn)檢測(cè)。直接檢測(cè)細(xì)胞中的切割位點(diǎn)，靈敏度與細(xì)胞、組織密切相關(guān)。LAM-HTGTS，片段化的gDNA經(jīng)過(guò)LAM-PCR引入接頭，然后進(jìn)行全基因組易位測(cè)序。高通量的全基因組范圍檢測(cè)，可準(zhǔn)確檢測(cè)DSBs引發(fā)的重排。GUIDE-Seq，將dsODN s標(biāo)簽整合到DSBs位點(diǎn)，通過(guò)二代測(cè)序檢測(cè)這些標(biāo)簽所在的基因組區(qū)域，從而確定脫靶突變的位置。廣使用的細(xì)胞內(nèi)檢測(cè)方法。能檢測(cè)低頻脫靶突變。Digenome-Seq，片段化的gDNA與CRISPR/RNP混合孵育，進(jìn)行全基因組測(cè)序檢測(cè)脫靶...

Cas9蛋白是一種切割外來(lái)DNA的酶，像一把分子剪刀。該蛋白通常與兩個(gè)RNA分子結(jié)合：crRNA和另一個(gè)稱(chēng)為tracrRNA（或“反式j(luò)ihuocrRNA”）。這兩個(gè)RNA分子引導(dǎo)Cas9到它將進(jìn)行切割的目標(biāo)部位。這段DNA是與crRNA的20個(gè)核苷酸互補(bǔ)的。CRISPR技術(shù)是從細(xì)菌和古細(xì)菌的自然防御機(jī)制中改編而來(lái)的。這些生物體使用CRISPR衍生的RNA和各種Cas蛋白，包括Cas9，來(lái)阻止病毒和其他異物的攻擊。它們主要通過(guò)切碎和破壞外來(lái)入侵者的DNA來(lái)做到這一點(diǎn)。當(dāng)這些組件被轉(zhuǎn)移到其他更復(fù)雜的生物體中時(shí)，它允許對(duì)基因進(jìn)行操縱，或“編輯”。挑選前面的潛在脫靶位點(diǎn)，通過(guò)PCR測(cè)序驗(yàn)證是否脫靶。...

使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設(shè)計(jì)核酸酶進(jìn)行基因組編輯，可以將遺傳物質(zhì)定向?qū)氩溉閯?dòng)物基因組的特定位點(diǎn)。然而，可能會(huì)出現(xiàn)非預(yù)期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并破壞正?；虻墓δ埽瑥亩赡軐?dǎo)致臨床前和臨床研究中的安全問(wèn)題?；蚓庉嬆壳暗拿摪蟹治黾夹g(shù)主要依賴(lài)于生物信息學(xué)預(yù)測(cè)和全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)。這些預(yù)測(cè)缺乏可靠性，因?yàn)樗鼈冎缓w了潛在基因組改變的一小部分。而頻率低于0.5%的脫靶突變大多無(wú)法被全基因組脫靶檢測(cè)技術(shù)檢測(cè)到。我們是開(kāi)發(fā)用于全基因組靶向/非靶向分析的無(wú)偏分析的先驅(qū)。靶向基因組編輯唯可生物為基因編輯安全性評(píng)估提供多方面的PCR和基于NGS的分析。我...

基因編輯產(chǎn)品除了適用基因zhiliao產(chǎn)品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外，長(zhǎng)期隨訪中還應(yīng)額外關(guān)注脫靶風(fēng)險(xiǎn)，量化評(píng)估脫靶活性和在靶活性之間的相關(guān)性，或利用在靶活性來(lái)預(yù)測(cè)脫靶活性的水平。在開(kāi)發(fā)過(guò)程中應(yīng)同時(shí)關(guān)注基因轉(zhuǎn)導(dǎo)效率、脫靶效率、插入突變情況、目的基因在靶細(xì)胞中整合位點(diǎn)及表達(dá)。評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性，判斷是否需要開(kāi)展另外的遺傳毒性研究，評(píng)估插入突變（插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等）引起的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問(wèn)題；鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。非臨床研究是藥物開(kāi)發(fā)的重要環(huán)節(jié)之一。基因編輯技術(shù)脫靶檢測(cè)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)...

GUIDE-Seq脫靶評(píng)估技術(shù)的優(yōu)勢(shì)分析鼓潤(rùn)致力于基因組編輯工具脫靶的分析檢測(cè)工作，為篩選、優(yōu)化基因組編輯工具的保真性提供標(biāo)準(zhǔn)化的分析。我們脫靶分析具有如下優(yōu)勢(shì)：實(shí)用性強(qiáng)：能反映CRISPR在真核細(xì)胞中進(jìn)行基因編輯的在靶與脫靶情況，以進(jìn)行安全性和有效性評(píng)價(jià)；檢測(cè)通量高：一次能檢測(cè)多個(gè)樣本的在靶與脫靶情況，并通過(guò)優(yōu)化的標(biāo)簽設(shè)計(jì)，降低實(shí)際的測(cè)序reads數(shù)量；準(zhǔn)確性高：絕大部分檢測(cè)結(jié)果可被驗(yàn)證；靈敏度高：能夠高效檢測(cè)出低頻脫靶位點(diǎn)，檢測(cè)低至0.1%的脫靶突變；實(shí)驗(yàn)難度低：操作過(guò)程簡(jiǎn)單易行細(xì)胞適應(yīng)性強(qiáng)。如何檢測(cè)是否發(fā)生脫靶? 基因編輯的脫靶率檢測(cè)一般有兩種方法。深圳脫靶檢測(cè)評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會(huì)...

CRISPR基于sgRNA與基因組序列互補(bǔ)定位到靶位點(diǎn)，不論哪種CRISPR系統(tǒng)，都存在sgRNA序列不完全匹配但能夠結(jié)合基因組的脫靶現(xiàn)象，CRISPR定位到脫靶位點(diǎn)引發(fā)序列改變就屬于第二類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)。CRISPR技術(shù)誕生剛過(guò)10年，期間迅速取代TALEN和ZFN，成為學(xué)術(shù)界通用的基因編輯技術(shù)，也徹底改變了我們的生物學(xué)研究方法。為提高CRISPR技術(shù)的安全性，特別是往臨床應(yīng)用發(fā)展時(shí)的安全性問(wèn)題，研究者們一直以提高靶位點(diǎn)的編輯效率和準(zhǔn)確性，同時(shí)降低脫靶位點(diǎn)編輯發(fā)生概率為目標(biāo)，來(lái)優(yōu)化CRISPR技術(shù)。另一方面，研究者們也開(kāi)發(fā)了大量檢測(cè)方法，用于檢測(cè)CRISPR的靶向風(fēng)險(xiǎn)和脫靶風(fēng)險(xiǎn)，用于早期sgRNA序列...

堿基編輯器：CBE：胞嘧啶堿基編輯器(Cytosine base editor，CBE)，依賴(lài)于胞嘧啶核苷脫氨基酶，通過(guò)將胞嘧啶核苷脫氨轉(zhuǎn)換為尿嘧啶核苷，尿嘧啶核苷在DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)換為胸腺嘧啶核苷，從而實(shí)現(xiàn)C到T的轉(zhuǎn)換。已開(kāi)發(fā)出四代CBE（BE1、BE2、BE3和BE4），由于BE3引起的脫靶效應(yīng)相對(duì)較少，因此它已在動(dòng)物（小鼠）、細(xì)菌和植物細(xì)胞中廣用于編輯細(xì)胞的基因組成。腺嘌呤堿基編輯器(Adenine base editor，ABE)，依賴(lài)于腺嘌呤核苷脫氨基酶，通過(guò)將腺嘌呤核苷脫氨轉(zhuǎn)換為次黃苷，然后在DNA復(fù)制和修復(fù)過(guò)程中會(huì)轉(zhuǎn)換為鳥(niǎo)嘌呤核苷，從而實(shí)現(xiàn)腺嘌呤(A)到鳥(niǎo)嘌呤(G)的轉(zhuǎn)...

基因zhiliao產(chǎn)品特有的可能會(huì)引起遲發(fā)性不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產(chǎn)品可能會(huì)采用修飾宿主基因組的技術(shù)，并有可能在宿主細(xì)胞或組織中持續(xù)存在。很多基因zhiliao載體的基因整合不會(huì)指向基因組的特定位點(diǎn)，可能在整合位點(diǎn)處產(chǎn)生插入突變、或jihuo整合位點(diǎn)附近的原基因等，進(jìn)而破壞重要基因功能或增加惡性liu的風(fēng)險(xiǎn)，例如，國(guó)外已有多項(xiàng)研究報(bào)告在接受了使用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因修飾細(xì)胞zhiliao的受試者中發(fā)生白血病。因此，對(duì)于存在此類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)品，有必要進(jìn)行長(zhǎng)期隨訪臨床研究以評(píng)估出現(xiàn)遲發(fā)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。種子基因脫靶檢測(cè)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專(zhuān)業(yè)性高，檢測(cè)效...

近幾年，細(xì)胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）領(lǐng)域發(fā)展迅猛，在多個(gè)方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA為代的多種CAR-T免疫細(xì)胞療法攻克了一部分血液瘤，多種AAV療法也給一些難以成藥的罕見(jiàn)病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因編輯技術(shù)的眾多基因療法也進(jìn)展迅速，較早體外基因編輯療法較快今年年底能夠上市（CRISPR Therapeutics CTX001），體內(nèi)基因編輯療法取得了不錯(cuò)的臨床數(shù)據(jù)（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技術(shù)制造的通用型CAR-T療法也是免疫細(xì)胞療...

國(guó)內(nèi)外基因zhiliao產(chǎn)品開(kāi)展的非臨床研究、長(zhǎng)期隨訪獲得的臨床經(jīng)驗(yàn)以及基因組整合位點(diǎn)分析方法的明顯改進(jìn)，都有助于更好地理解整合性基因zhiliao載體相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)。通常認(rèn)為，很多能夠介導(dǎo)外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞核的載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、轉(zhuǎn)座子元件和基因編輯產(chǎn)品等）有基因組整合潛力，需要通過(guò)長(zhǎng)期隨訪觀察遲發(fā)性不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)；根據(jù)目前的認(rèn)識(shí)和研究數(shù)據(jù)，質(zhì)粒、痘病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒（AAV）等載體的基因zhiliao產(chǎn)品整合風(fēng)險(xiǎn)較低，國(guó)際上開(kāi)展的臨床試驗(yàn)中也表現(xiàn)出較低的遲發(fā)性不良反應(yīng)風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)載體或基因zhiliao產(chǎn)品原有的風(fēng)險(xiǎn)特征增加時(shí)，例如經(jīng)過(guò)修飾以攜帶基因組編輯成分的質(zhì)?；蚋淖兘oyaofang式以...

對(duì)于CAR修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)采用多種體外方法評(píng)估其胞外抗原識(shí)別區(qū)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。TCR修飾免疫細(xì)胞的脫靶毒性可通過(guò)評(píng)估TCR與人體自身抗原肽的交叉識(shí)別能力來(lái)評(píng)估。首先，應(yīng)采用體外試驗(yàn)測(cè)定TCR修飾的免疫細(xì)胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復(fù)合物的親和力，并說(shuō)明抗原肽的選擇依據(jù)及選擇范圍。此外，還應(yīng)研究其他相關(guān)或不相關(guān)的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應(yīng)可能，應(yīng)確定靶抗原肽的較小識(shí)別基序（motif），并采用計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)分析評(píng)估交叉反應(yīng)性。如果計(jì)算機(jī)預(yù)測(cè)可識(shí)別出具有潛在交叉反應(yīng)性的抗原肽，應(yīng)在體外測(cè)定TCR修飾免疫細(xì)胞對(duì)表達(dá)相應(yīng)蛋白或遞呈相應(yīng)抗原...

采用基因編輯技術(shù)制備的細(xì)胞產(chǎn)品。對(duì)于采用基因編輯技術(shù)制備的基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)進(jìn)行體外在靶和脫靶活性評(píng)估，以確認(rèn)修飾酶或向?qū)NA對(duì)靶基因序列的特異性。在評(píng)估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)說(shuō)明所選擇的評(píng)價(jià)策略的合理性和敏感性。雖然采用計(jì)算機(jī)分析預(yù)測(cè)基因編輯的潛在脫靶位點(diǎn)，并對(duì)潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行深度測(cè)序分析，可用于評(píng)估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)；但選擇的評(píng)價(jià)策略仍應(yīng)包含體外全基因組測(cè)序比對(duì)，以證明潛在脫靶位點(diǎn)未出現(xiàn)脫靶。此外，在評(píng)估脫靶活性時(shí)，還應(yīng)評(píng)估種屬特異性的差異、細(xì)胞病理生理狀態(tài)的差異或細(xì)胞類(lèi)型的差異對(duì)非臨床數(shù)據(jù)預(yù)測(cè)性的影響。必要時(shí)，還應(yīng)分析基因編輯對(duì)細(xì)胞表型和生理功能的潛在影響。種子基因脫靶檢測(cè)，推薦唯...

近幾年，細(xì)胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）領(lǐng)域發(fā)展迅猛，在多個(gè)方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA為代的多種CAR-T免疫細(xì)胞療法攻克了一部分血液瘤，多種AAV療法也給一些難以成藥的罕見(jiàn)病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因編輯技術(shù)的眾多基因療法也進(jìn)展迅速，較早體外基因編輯療法較快今年年底能夠上市（CRISPR Therapeutics CTX001），體內(nèi)基因編輯療法取得了不錯(cuò)的臨床數(shù)據(jù)（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技術(shù)制造的通用型CAR-T療法也是免疫細(xì)胞療...