實(shí)驗(yàn)原理：CellCountingKit-8（簡稱CCK-8）試劑可用于簡便而準(zhǔn)確的細(xì)胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-MethoxyPMS）的作用下被細(xì)胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產(chǎn)物（Formazandye）。生成的甲瓚物的數(shù)量與活細(xì)胞的數(shù)量成正比。因此可利用這一特性直接進(jìn)行細(xì)胞增殖和毒性分析。細(xì)胞增殖與毒性檢測實(shí)驗(yàn)方法及經(jīng)驗(yàn)總結(jié)-CCK-8 法.浙江cck8增殖數(shù)據(jù)結(jié)果
四、方法及步驟：實(shí)驗(yàn)一：細(xì)胞增殖分析1、制備細(xì)胞懸液：細(xì)胞計(jì)數(shù)。2、接種到96孔板中：根據(jù)合適的鋪板細(xì)胞數(shù)（約1-2×104），每孔約100ul細(xì)胞懸液，同樣的樣本可做4-6個重復(fù)。3、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)：細(xì)胞接種后貼壁大約需要培養(yǎng)4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。4、加入10ulCCK8：由于每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議將***頭浸入培養(yǎng)液中加入且在加完試劑后輕輕敲擊培養(yǎng)板以幫助混勻?；蛘咧苯优渲煤?0%CCK8的培養(yǎng)基（現(xiàn)用現(xiàn)配），以換液的形式加入。北京cck8接種細(xì)胞密度這個CCK-8的英文全稱是Cell Counting Kit-8.
摸條件包括1、種板數(shù)；2、種板后細(xì)胞的貼壁生長時間；3、加藥后的孵育時間；4、cck8試劑加入量；5、cck8試劑加入后細(xì)胞孵育時間?？雌饋砗芏啵鋵?shí)這就是一個實(shí)驗(yàn)。而且都是種的空白板，也就是不加藥物，只加細(xì)胞和CCK8。我沒有做過MTT實(shí)驗(yàn)，但其實(shí)原理及目的都是一樣的（反應(yīng)機(jī)理不一樣）。都說CCK8簡單點(diǎn)而且數(shù)據(jù)更穩(wěn)定，所以就用了這個試劑盒。
當(dāng)然仁者見仁智者見智，我寫的只是個人實(shí)驗(yàn)心得，但供參考。歡迎大家拍磚共同進(jìn)步。實(shí)驗(yàn)是簡單的，道路是曲折的，時間就是用來浪費(fèi)的，科研就是自娛自樂使勁折騰。
在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1-4小時，對于大多數(shù)情況孵育2小時左右就可以了。6.用酶標(biāo)儀測定在450nm處的吸光度（使用酶標(biāo)儀之前要提前開啟10min預(yù)熱）測定完成后，保存數(shù)據(jù)。7.連續(xù)五天檢測，每天保持一樣的時間點(diǎn)加入CCK-8溶液，在培養(yǎng)箱內(nèi)孵育時間相同。注：若暫時不測定OD值，可以向每孔中加入10μL0.1M的HCL溶液或者1%w/vSDS溶液，并遮蓋培養(yǎng)板避光保存在室溫條件下。24小時內(nèi)測定，吸光度不會發(fā)生變化。如果待測物質(zhì)有氧化性或還原性的話，可在加CCK8之前更換新鮮培養(yǎng)基（除去培養(yǎng)基，并用培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞兩次，然后加入新的培養(yǎng)基），去掉***影響。當(dāng)然***影響比較小的情況下，可以不更換培養(yǎng)基，直接扣除培養(yǎng)基中加入***后的空白吸收即可?；瘜W(xué)名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基).
用途：
***篩選、
細(xì)胞增殖測定、
細(xì)胞毒性測定、
**藥敏試驗(yàn)等。
所需設(shè)備及儀器：
10ul，100-200ul及多通道移液器
酶標(biāo)儀（帶有450nm濾光片）
96孔培養(yǎng)板
二氧化碳培養(yǎng)箱
培養(yǎng)0.5-4小時:細(xì)胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續(xù)培養(yǎng)，以確認(rèn)比較好條件。特別是血液細(xì)胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。
測定450nm吸光度：建議采用雙波長進(jìn)行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。 若細(xì)胞培養(yǎng)時間較長，培養(yǎng)基顏色或 pH 發(fā)生變化，建議更換培養(yǎng)基后再加 CCK-8.上海cck8出問題
***篩選：在測定一個***的毒性和安全有效濃度時，經(jīng)常會用到CCK-8。浙江cck8增殖數(shù)據(jù)結(jié)果
當(dāng)使用標(biāo)準(zhǔn)96孔板時，貼壁細(xì)胞的**小接種量至少為1000 個/孔(100μl培養(yǎng)基)。檢測白細(xì)胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2500 個/孔(100μl培養(yǎng)基)。酚紅和血清對CCK8法的檢測不會造成干擾，可以通過扣除空白孔中本底的吸光度而消去。
注意事項(xiàng)CCK8可以檢測大腸桿菌，但不能檢測酵母細(xì)胞。在細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)每次測定的過程中需要避免細(xì)菌污染，以免影響結(jié)果。CCK-8在0-5℃下能夠保存至少6個月，在-20℃下避光可以保存1年。當(dāng)在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)時，培養(yǎng)板**外一圈的孔**容易干燥揮發(fā)，由于體積不準(zhǔn)確而增加誤差。一般情況下，**外一圈的孔只加培養(yǎng)基，不作為測定孔用。在培養(yǎng)基中加入CCK8，培養(yǎng)一定的時間，測定450 nm的吸光度即為空白對照。 浙江cck8增殖數(shù)據(jù)結(jié)果
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