DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、和甲酰胺等。這類保護(hù)劑能夠在細(xì)胞冷凍懸液完全凝固之前,穿過細(xì)胞膜滲透到細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度,降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度,從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷。同時,細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲,避免了細(xì)胞過分脫水皺縮。非滲透性冷凍保護(hù)劑一般是些大分子物質(zhì),不能滲透到細(xì)胞內(nèi)。該類保護(hù)劑主要包括聚yi烯吡ge烷酮、蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白及***等。其保護(hù)機(jī)制的假設(shè)很多,其中一種可能是,聚yi烯吡ge烷酮等大分子物質(zhì)可以優(yōu)先同溶液中的水分子相結(jié)合,降低溶液中自由水的含量。使冰點(diǎn)降低。減少冰晶的形成;同時,由于其分子量大,使溶液中電解質(zhì)濃度降低,從而減輕溶質(zhì)損傷。01細(xì)胞凍存的原理細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一,也是保持細(xì)胞活性和增殖能力的重要手段。細(xì)胞可以通過被暫時休眠(凍存),仿佛童話里的睡美人,留住年輕芳華,等到需要時再被輕輕喚醒(復(fù)蘇)。低溫下,活細(xì)胞中的生物和化學(xué)反應(yīng)都會極大降低,為細(xì)胞長期凍存提供了可能。冷凍對大多數(shù)活生物體都是致命的,細(xì)胞凍存是利用冷凍保護(hù)劑來降低冰點(diǎn),緩慢凍結(jié)細(xì)胞的過程中,細(xì)胞內(nèi)水分透出細(xì)胞。無血清細(xì)胞凍存液合作需要聯(lián)系誰?連云港快速細(xì)胞凍存液保質(zhì)期
常須將培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存,并在需要的時候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。目前,細(xì)胞凍存**常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法,主要采用加適量保護(hù)局的緩慢冷凍法保存細(xì)胞。無血清非程序細(xì)胞凍存液,添加了細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑可防止或延緩細(xì)胞在凍存過程中的沉降,防止細(xì)胞互相擠壓,影響細(xì)胞凍存效果。另外添加了細(xì)胞膜保護(hù)劑。滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑、非滲透性細(xì)胞保護(hù)劑等多種冷凍保護(hù)劑,它們在溶液中同水分子結(jié)合,發(fā)生水合作用,弱化水的結(jié)晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成,能**降低細(xì)胞在凍存過程中冰晶對于細(xì)胞的損傷,有效提高細(xì)胞復(fù)蘇率和活力。同時無任何外源血清成分,減少細(xì)胞污染機(jī)會,并且無需繁瑣的程序凍存步驟,節(jié)省了大量時間和精力。內(nèi)***:<支原體:陰性微生物檢查:陰性滲透壓:280-340m0smol/kgPH:純度:>98%保存溫度:4℃避光保存有效期:24個月應(yīng)用:?干細(xì)胞儲存?T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的儲存?其他額種類型哺乳動物細(xì)胞的儲存產(chǎn)品特性:?無需程序降溫,直接置于-80℃冰箱,后置于液氮保存?1類醫(yī)療器械生產(chǎn)許可?無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)可用于臨床。上海快速細(xì)胞凍存液公司無血清細(xì)胞凍存液應(yīng)細(xì)胞復(fù)蘇率高達(dá)90%以上。
它的各種生物特性都將逐漸發(fā)生變化并隨著傳代次數(shù)的增加和體外環(huán)境條件的變化而不斷有新的變化。因此及時進(jìn)行細(xì)胞凍存十分必要。細(xì)胞冷凍儲存在-70℃冰箱中可以保存一年之久;細(xì)胞儲存在液氮中,溫度達(dá)-196℃,理論上儲存時間是無限的。原理:細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融,實(shí)驗(yàn)證明這樣可以**大限度的保存細(xì)胞活力。如今細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑,這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對水的通透性,加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外,減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成,從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法,這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時間內(nèi)即融化,避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對細(xì)胞造成損傷。操作步驟編輯播報材料(一)儀器1.凈化工作臺2.離心機(jī)3.恒溫水浴箱4.冰箱(4℃、-20℃、-70℃)5.倒置相差顯微鏡6.培養(yǎng)箱7.液氮冰箱(二)玻璃器皿1.吸管(彎頭、直頭)2.培養(yǎng)瓶3.玻璃瓶(250ml、100ml)4.廢液缸(三)塑料器皿1.吸頭2.***頭3.膠塞4.移液管(10ml)(1~2ml)(四)其他物品1.微量加樣***2.紅血球計(jì)數(shù)板3.記號筆4.醫(yī)用橡皮膏(五)試劑(青霉素、鏈霉素)5.胰蛋白酶()。
本發(fā)明的目的在于提供一種細(xì)胞凍存液,使凍存培養(yǎng)后的細(xì)胞具有成活率高的優(yōu)點(diǎn),同時滿足凍存液成分簡單、成本低等要求。本發(fā)明是通過如下技術(shù)方案得以實(shí)現(xiàn)上述目的。***方面,本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液,所述細(xì)胞凍存液的成分如下:將上述組分加入到工業(yè)用水中,用于配置得到細(xì)胞凍存液。該細(xì)胞凍存液采用聯(lián)合滲透性和非滲透性保護(hù)液組合方案,細(xì)胞凍存液在完全凝固之前,滲透到細(xì)胞內(nèi),在細(xì)胞內(nèi)外產(chǎn)生一定的摩爾濃度,降低細(xì)胞內(nèi)外未結(jié)冰溶液中電解質(zhì)的濃度,從而保護(hù)細(xì)胞免受高濃度電解質(zhì)的損傷,同時細(xì)胞內(nèi)水分也不會過分外滲,避免細(xì)胞過分脫水皺縮。第二方面,本發(fā)明提供了一種細(xì)胞凍存液的使用方法,所述方法包括如下步驟:1)凍存液制備:制備本發(fā)明***方面所述的細(xì)胞凍存液,將各組分按照常規(guī)的操作方法及相應(yīng)的比例混合即可獲得;2)細(xì)胞懸液制備:a.將培養(yǎng)細(xì)胞用%乙二胺四乙酸二鈉鹽(edta·2na)或%胰蛋白酶消化3~7min(根據(jù)室溫情況而定),至光鏡下見到貼壁細(xì)胞間出現(xiàn)篩狀間隙為止,棄去消化液,加pbs液;b.用吸管將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹打下來,并移入離心管中;~1000r/min,短時低速離心5min;d.棄上清,加~8ml,低速短時離心,800~1000r/min離心3~5min。無血清細(xì)胞凍存液有效期一年。
再放入-80℃冰箱冷凍過夜,次日保存到液氮罐中。目前更多使用程序降溫盒,將細(xì)胞凍存管放于盒內(nèi),直接置于超低溫冰箱,程序降溫盒可控制每分鐘下降1℃。目前也有商業(yè)化的快速凍存液,可不經(jīng)過程序降溫過程,直接置于超低溫冰箱。注:細(xì)胞凍存后可以長期保存,但為妥善起見,凍存半年后,**好取出一支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng),觀察生長情況,然后再繼續(xù)凍存。懸浮細(xì)胞的凍存1.直接將細(xì)胞收集到離心管,棄上清3.以生長培養(yǎng)基(含20%胎牛血清)或100%胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約107/ml,加入10%的DMSO。4.以每管1ml分裝至凍存管中。5.置于4oC30min,再轉(zhuǎn)入-20℃2h后,再放入-80℃冰箱冷凍過夜,次日保存到液氮罐中;或置于程序降溫盒中,按相關(guān)的操作指南進(jìn)行操作。液氮罐使用注意事項(xiàng)1.初次使用前檢查容器內(nèi)膽是否清潔干燥,外部有無凹陷及嚴(yán)重碰傷,如有輕微凹陷及碰傷,經(jīng)試驗(yàn)其蒸發(fā)性能不變,仍可繼續(xù)使用,如性能下降,應(yīng)停止使用,避免經(jīng)濟(jì)損失。2.液氮容器應(yīng)放在陰涼干燥處,應(yīng)有良好的通風(fēng),不應(yīng)放置在靠近熱源,陽光直照,以及風(fēng)口處,嚴(yán)禁放置液氮容器的房間緊閉門窗,以免室內(nèi)因液氮蒸發(fā)使氧氣含量下降,造成呼吸困難。3.只能用于充裝液氮,凍存細(xì)胞和病毒用。無血清細(xì)胞凍存液使用濃度怎么樣?連云港快速細(xì)胞凍存液哪家好
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所以非程序降溫凍存方法便應(yīng)運(yùn)而生,它能極大簡化凍存流程,細(xì)胞可直接置于-80°C冰箱完成凍存過程,更為簡便高效。03細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的比較好時間細(xì)胞在體外生長期間,通常分為三個階段:潛伏期、指數(shù)生長期和平臺期。潛伏期通常是細(xì)胞剛剛傳代,此時細(xì)胞開始貼附基質(zhì)和伸展骨架,代謝活動集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表達(dá),細(xì)胞數(shù)量在這段時間內(nèi)幾乎沒有增加。隨后,細(xì)胞開始指數(shù)生長期,轉(zhuǎn)錄翻譯過程旺盛,胞內(nèi)物質(zhì)、信號傳遞迅速,細(xì)胞數(shù)量迅速增長。如果在這個時期凍存,實(shí)際上是強(qiáng)行將細(xì)胞凍結(jié)在代謝的某一時刻,勢必造成對解旋的DNA、轉(zhuǎn)錄翻譯中的RNA和蛋白的機(jī)械損傷,增加個別環(huán)節(jié)發(fā)生錯誤的風(fēng)險。隨著細(xì)胞數(shù)量的增長,培養(yǎng)容器內(nèi),細(xì)胞匯合達(dá)到90%以上。大部分細(xì)胞因?yàn)椤敖佑|抑制”而停止高速代謝和增殖,胞內(nèi)活動趨于平緩。所以,建議在剛剛進(jìn)入平臺期時凍存細(xì)胞,既可以獲得足量的細(xì)胞,也不會對細(xì)胞造成過多的機(jī)械損傷。參考文獻(xiàn):1.吳敬智,繆著,馬波,劉馨.影響懸浮細(xì)胞冷凍保存的因素分析[J].中國生物醫(yī)學(xué)技術(shù),2020,10(15):512-517.細(xì)胞凍存液的配方是什么?(一)細(xì)胞凍存1.配制含10%DMSO或甘油、10~20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液;2.取對數(shù)生長期的細(xì)胞。連云港快速細(xì)胞凍存液保質(zhì)期