《Nat Commun》解讀：去磷酸化抑制泛素化！

結(jié)直腸AI （CRC）的發(fā)病機(jī)制是多方面的，涉及控制腸上皮細(xì)胞增殖、凋亡和存活的多種細(xì)胞信號(hào)通路的失調(diào)。Notch1在AI癥發(fā)展中發(fā)揮多種作用，目前尚不清楚是否存在能夠使裂解的Notch1跨膜/細(xì)胞內(nèi)區(qū)（NTM）去磷酸化以調(diào)節(jié)其功能的磷酸酶。雙特異性蛋白磷酸酶（DUSPs，也稱為MAPK磷酸酶）DUSP6是否參與和調(diào)節(jié)功能尚不清楚。

2024年11月，新加坡國立大學(xué)團(tuán)隊(duì)在Nat Commun.（IF=14.7）上發(fā)表了題為“DUSP6 regulates Notch1 signalling in colorectal cancer”的研究成果。發(fā)現(xiàn)DUSP6是一種Notch1磷酸酶，揭示了Notch1在AI癥中的調(diào)控和功能，并為靶向Notch1信號(hào)開發(fā)人類疾病治L提供了新的途徑。

Highlights如下：

1）腫LIU 中DUSP6高表達(dá)與較差的CRC患者總生存率相關(guān)；

2）DUSP6促進(jìn)細(xì)胞生長和遷移；

3）小鼠中DUSP6的缺失導(dǎo)致結(jié)腸腫LIU 發(fā)展減少；

4）機(jī)制上，DUSP6使Notch1 phospho-Y2116去磷酸化，從而降低NTM泛素化，從而提高NTM的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，促進(jìn)腫LIU 細(xì)胞生長。

備注：Notch1在AI癥中的激HUO是通過Notch1細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域的磷酸化來調(diào)節(jié)的。Notch1的激HUO是通過結(jié)合其配體，δ樣蛋白1和3，或Jagged 1和2來啟動(dòng)的。隨后經(jīng)蛋白水解裂解，釋放Notch細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)域（NICD）， NICD易位到細(xì)胞核中轉(zhuǎn)錄增殖相關(guān)基因，如c-Myc。NICD的磷酸化調(diào)控其穩(wěn)定性，是決定其生物活性的關(guān)鍵過程。雖然已知裂解的NICD通過相應(yīng)的激酶磷酸化可以調(diào)節(jié)生物活性，但磷酸酶的調(diào)節(jié)仍未被探索。NTM：Notch1跨膜/細(xì)胞內(nèi)區(qū)。

臨床相關(guān)性：

腫LIU 中DUSP6高表達(dá)與與高NICD水平和較差的CRC患者總生存率相關(guān)。

功能研究：

DUSP6表達(dá)升高導(dǎo)致CRC細(xì)胞體外和體內(nèi)增殖增強(qiáng)，小鼠中DUSP6的缺失導(dǎo)致結(jié)腸腫LIU 發(fā)展減少。

機(jī)制研究：

（1）DUSP6抑制MAPKs的激HUO，增加Notch1 NTM的水平

第一步，DUSP6抑制MAPKs的激HUO

DUSP6已被證明主要靶向ERK1/2。WB檢測顯示，過表達(dá)DUSP6導(dǎo)致ERK1/2、p38和JNK的激HUO降低，敲除DUSP6則增加其激HUO（圖1a）。另外，過表達(dá)DUSP6增加了增殖相關(guān)基因COX2和c-MYC的表達(dá)，DUSP6的缺失則相反（圖1a-1b）。

第二步，DUSP6增加Notch1 NTM的水平

據(jù)報(bào)道Notch1與CRC患者預(yù)后較差相關(guān)。Notch1作為一種跨膜受體蛋白，其激HUO需要γ-分泌酶對(duì)其進(jìn)行蛋白水解裂解，釋放被裂解的Notch1細(xì)胞內(nèi)區(qū)域，用于靶標(biāo)增殖相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄激HUO或與其他細(xì)胞因子的合作。Notch1切割量的變化會(huì)對(duì)細(xì)胞增殖產(chǎn)生積極影響。DUSP6的過表達(dá)導(dǎo)致NTM（Notch1一個(gè)短的細(xì)胞外近膜肽和一個(gè)分子量為120 kDa的跨膜序列）水平升高，而敲除DUSP6導(dǎo)致NTM水平降低（圖1c）。表明DUSP6的表達(dá)與NTM水平呈正相關(guān)。

圖1 DUSP6抑制MAPKs的激HUO，增加Notch1 NTM的水平（Ref. Fig 2/S4）

（2）DUSP6抑制泛素介導(dǎo)的NICD蛋白酶體降解

被切割的Notch1細(xì)胞內(nèi)區(qū)域作為轉(zhuǎn)錄激HUO因子，激HUO參與腫LIU 發(fā)育的各種基因。切割的Notch1細(xì)胞內(nèi)區(qū)域活性可以通過磷酸化來調(diào)節(jié)，以標(biāo)記泛素介導(dǎo)的蛋白酶體降解。然而，沒有報(bào)道任何負(fù)調(diào)節(jié)因子可以使Notch1細(xì)胞內(nèi)區(qū)域去磷酸化，從而保持其細(xì)胞活性/豐度。DUSP6與NTM水平的相關(guān)性提示DUSP6可能調(diào)控NTM。

第一步，DUSP6與NTM結(jié)合

Co-IP實(shí)驗(yàn)顯示內(nèi)源性NTM可與細(xì)胞中flag-DUSP6結(jié)合；同時(shí)，內(nèi)源性DUSP6可與HA-NTM結(jié)合（圖2a-b）。表明DUSP6與NTM結(jié)合。

第二步，DUSP6能夠直接使NTM去磷酸化

體外去磷酸化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與DUSP6孵育后，NTM上總磷酪氨酸的數(shù)量減少了約55%（圖2c）。同樣，DUSP6能夠使內(nèi)源性NTM去磷酸化（圖2d-e）。表明DUSP6能夠直接使NTM去磷酸化。

第三步，DUSP6對(duì)NTM的去磷酸化可以降低NTM的泛素化

接下來，進(jìn)行連續(xù)的去磷酸化和泛素化實(shí)驗(yàn)，以測試DUSP6對(duì)NTM的去磷酸化是否會(huì)導(dǎo)致泛素化降低。純化NTM，然后與DUSP6孵育進(jìn)行去磷酸化。然后將所得的NTM用作體外泛素化試驗(yàn)的樣本。結(jié)果顯示，NTM與DUSP6孵育后檢測到總磷酪氨酸減少，同時(shí)，去磷酸化NTM上的泛素化量減少了約38%（圖2f）。表明，DUSP6對(duì)NTM的去磷酸化可以降低NTM的泛素化。

第四步，DUSP6抑制NTM泛素化以增強(qiáng)其穩(wěn)定性

接下來，探索DUSP6引發(fā)的NTM泛素化降低是否會(huì)導(dǎo)致蛋白酶體介導(dǎo)的降解變化。敲減DUSP6并使用MG132（一種有效的蛋白酶體抑制劑）處理細(xì)胞，檢測NTM的水平。發(fā)現(xiàn)DUSP6敲減，NTM明顯降低；MG132處理后，NTM水平增加（圖2g）。此外，Co-IP實(shí)驗(yàn)分析顯示DUSP6與NTM泛素化水平負(fù)相關(guān)，與NTM水平正相關(guān)（圖2h）。表明DUSP6抑制NTM泛素化以增強(qiáng)其穩(wěn)定性。

圖2 DUSP6抑制泛素介導(dǎo)的NICD蛋白酶體降解（Ref. Fig 5/S7）

（3）DUSP6對(duì)Notch1的phospho-Y2116的去磷酸化是其調(diào)控CRC細(xì)胞增殖的關(guān)鍵

功能回復(fù)實(shí)驗(yàn)顯示，DUSP6通過Notch1調(diào)控結(jié)直腸AI 細(xì)胞增殖（圖3a-b）。隨后IP-MS篩選NTM上可能被DUSP6靶向的磷酸化位點(diǎn)。NTM中總共檢測到17個(gè)磷酸絲氨酸、3個(gè)磷酸蘇氨酸和2個(gè)磷酸酪氨酸，其中只有phospho-Y2116（p-Y2116）是DUSP6過表達(dá)時(shí)失去磷酸化的酪氨酸殘基。此外，兩個(gè)絲氨酸殘基S1951和S2205在DUSP6 過表達(dá)中也失去了磷酸化。

為了確定p-Y2116、p-S1951和p-S2205在Notch1信號(hào)傳遞中的重要性，構(gòu)建Notch1失活突變體Y2116A、S1951A和S2205A，通過CSL（CBF1/RBP-Jκ）報(bào)告基因和Notch1通路報(bào)告基因檢測。發(fā)現(xiàn)DUSP6過表達(dá)導(dǎo)致Notch1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性增加，NICD Y2116A的細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄活性增加（圖3c）。表明在這三種突變中，只有Y2116A突變使NTM具有逃避泛素化和隨后的蛋白酶體降解的能力。隨后的功能實(shí)驗(yàn)也顯示NTM WT和NTM Y2116A均能挽救DUSP6 KO細(xì)胞增殖減少的情況（圖3d）。表明Y2116是DUSP6控制Notch1活性的磷酸化位點(diǎn)。

圖3 DUSP6對(duì)Notch1的phospho-Y2116的去磷酸化是其調(diào)控CRC細(xì)胞增殖的關(guān)鍵（Ref. Fig 6）

結(jié)論：研究人員發(fā)現(xiàn)DUSP6可以作為Notch1的磷酸酶，從而調(diào)節(jié)NTM的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性，從而影響結(jié)直腸AI （CRC）的發(fā)展。腫LIU 中DUSP6高表達(dá)與較差的CRC患者總生存率相關(guān)，DUSP6表達(dá)升高與NTM水平升高相關(guān)。DUSP6過表達(dá)導(dǎo)致CRC細(xì)胞體外和體內(nèi)增殖增強(qiáng)，DUSP6缺乏導(dǎo)致結(jié)直腸AI 發(fā)展減少。在機(jī)制上，DUSP6使Notch1 phospho-Y2116去磷酸化，從而降低NTM泛素化，從而提高NTM的穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)錄活性。為靶向Notch1信號(hào)開發(fā)人類疾病治L提供了新的途徑。