細(xì)胞基因治療產(chǎn)品用宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)常見(jiàn)問(wèn)題分析

宿主細(xì)胞蛋白（HCPs）是生物制品生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的關(guān)鍵工藝相關(guān)雜質(zhì)之一，可導(dǎo)致患者不良的免疫反應(yīng)、超敏反應(yīng)，另外也存在導(dǎo)致產(chǎn)品蛋白的降解等問(wèn)題，影響產(chǎn)品的安全性和有效性，是一項(xiàng)關(guān)鍵質(zhì)控指標(biāo)。HCPs殘留檢測(cè)應(yīng)用常用的方法是ELISA法，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，通量較高，是HCPs殘留檢測(cè)的日常放行檢方法，各國(guó)藥典規(guī)定了用酶聯(lián)免疫法進(jìn)行HCPs殘留檢測(cè)。然而，ELISA 方法檢測(cè)HCP殘留仍面臨諸多挑戰(zhàn)。在實(shí)際的工藝生產(chǎn)過(guò)程中，宿主來(lái)源、生產(chǎn)工藝、純化方式、生產(chǎn)規(guī)模等因素均可能對(duì)HCPs的種類及復(fù)雜性產(chǎn)生影響。

湖州申科生物CHO-K1 HCP 殘留檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）基于固相酶聯(lián)免疫吸附分析法，適用于基于CHO-K1細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品中宿主殘留蛋白的定量檢測(cè)。該分析方法通過(guò)在預(yù)包被抗CHO-K1HCPs綿羊多抗的酶標(biāo)板中加入校準(zhǔn)品或待測(cè)樣品、HRP標(biāo)記的抗CHO-K1HCPs綿羊多抗進(jìn)行共孵育。洗滌后，加入TMB底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，再使用終止液終止酶催化反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)讀吸光度，其吸光度與校準(zhǔn)品或待測(cè)樣品中的HCPs濃度成正相關(guān)，通過(guò)校準(zhǔn)品擬合的劑量-反應(yīng)曲線即可計(jì)算得出待測(cè)樣品中HCPs的濃度。本試劑盒對(duì)待測(cè)樣品無(wú)需進(jìn)行特殊處理，只需通過(guò)合適的稀釋比例進(jìn)行適用性驗(yàn)證即可直接使用。本試劑盒操作步驟少，快速，檢測(cè)專一性強(qiáng)，性能穩(wěn)定可靠。

大腸埃希氏菌(Escherichia coli，E. coli )又稱大腸桿菌，其作為模式微生物被廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)研究中。大腸桿菌是表達(dá)藥用異源蛋白的常用微生物，在被批準(zhǔn)的藥用蛋白中，大約30%的產(chǎn)品以大腸桿菌作為表達(dá)宿主菌。與其他表達(dá)平臺(tái)一樣，盡管下游復(fù)雜的純化步驟已經(jīng)去除了大量的雜質(zhì)，但終產(chǎn)品中仍會(huì)存在HCP殘留風(fēng)險(xiǎn)，必須對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制，使其符合放行標(biāo)準(zhǔn)。湖州申科生物E.coli表達(dá)菌HCP殘留檢測(cè)試劑盒用于大腸桿菌表達(dá)菌株BL21來(lái)源的宿主細(xì)胞蛋白定量檢測(cè)，適用于重組蛋白類產(chǎn)品的工藝中間品和原液類樣品，如白細(xì)胞介素（IL）、干擾素（rhIFN）、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子（rhGM-CSF）、腫瘤壞死因子（rhTNF）、促生長(zhǎng)因子（EGF/FGF/PDGF）等。試劑盒檢測(cè)步驟少，快速，專一性強(qiáng)，性能穩(wěn)定可靠。

LC-MS/MS 作為一種成熟可靠的蛋白質(zhì)組分析技術(shù)，憑借其超高的分辨率與準(zhǔn)確度在生物分析領(lǐng)域占據(jù)重要地位。該技術(shù)不僅能實(shí)現(xiàn)對(duì)低含量宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCP）的定性檢測(cè)，還可通過(guò)建立專屬蛋白質(zhì)譜庫(kù)準(zhǔn)確鑒定 HCP 的具體種類，為深入解析殘留蛋白組成提供關(guān)鍵支撐。不過(guò)，其應(yīng)用過(guò)程中面臨的關(guān)鍵挑戰(zhàn)在于，如何優(yōu)化 LC-MS 方法以滿足 GMP 規(guī)范中對(duì)產(chǎn)品放行檢測(cè)的嚴(yán)格要求。在質(zhì)譜檢測(cè)環(huán)節(jié)，通過(guò)引入表征清晰的內(nèi)標(biāo)與外標(biāo)蛋白，能夠準(zhǔn)確分析 HCPs 的整體組成，并有效鑒別其中具有潛在風(fēng)險(xiǎn)的高風(fēng)險(xiǎn)蛋白。這一技術(shù)手段不僅為開(kāi)發(fā)產(chǎn)品專屬的 HCP ELISA 檢測(cè)方法提供有力數(shù)據(jù)支持，還能助力工藝優(yōu)化升級(jí)，加速推動(dòng)生物制品從研發(fā)到獲批上市的全流程進(jìn)程。

在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)的分析方法中， ELISA方法是廣泛應(yīng)用的，并作為QC日常放行檢測(cè)的主要手段。ELISA方法相對(duì)簡(jiǎn)單、精度良好，方便設(shè)定控制范圍和建立技術(shù)規(guī)范，適用于產(chǎn)品開(kāi)發(fā)和過(guò)程控制；但ELISA方法檢測(cè)依靠抗原抗體特異性結(jié)合，因此用存在于生物制品中的HCPs作為免疫原生產(chǎn)出的抗體質(zhì)量至關(guān)重要。無(wú)論是商品化ELISA試劑盒，還是自制的多克隆抗體，如果抗體的特異性和適用性不夠高，都有可能帶來(lái)HCPs漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，從而對(duì)生物制品質(zhì)量安全帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)。除此之外，ELISA檢測(cè)HCPs使用多克隆抗體，無(wú)法針對(duì)性的提供高風(fēng)險(xiǎn)HCPs殘留蛋白真實(shí)存在情況。

美國(guó)藥典<1132>章節(jié) 和歐洲藥典<2.6.34>章節(jié)建議對(duì)于即將進(jìn)入商業(yè)化生產(chǎn)的（臨床III期及以后）或生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的生物制品采用定制化ELISA試劑盒進(jìn)行宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)，原因可能是：①確保檢測(cè)方法可以充分覆蓋實(shí)際工藝產(chǎn)生的HCPs，避免漏檢關(guān)鍵雜質(zhì)；②支持更準(zhǔn)確的免疫原性和安全性評(píng)估；③提供真實(shí)的工藝表征數(shù)據(jù)，而非推測(cè)數(shù)據(jù)；④滿足商業(yè)化生產(chǎn)質(zhì)量控制的方法一致性。此外，對(duì)目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的HCP ELISA商業(yè)化試劑盒進(jìn)行了測(cè)試，并與HCP ELISA定制化試劑盒進(jìn)行對(duì)比，實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同商業(yè)化試劑盒檢測(cè)同一樣品的檢測(cè)值差異大，且準(zhǔn)確性均低于定制化試劑盒，表明定制化試劑盒更能滿足產(chǎn)品質(zhì)量控制所需。