磷酸化蛋白的WB第三方檢測有哪些方法呢？50 度水浴 30min 后，用 TBST 洗 5 分鐘 ,3 次即可去除已孵育結(jié)合的抗體。許多人會(huì)建議 55 度水浴 30min。Strip solution 是用來去除已結(jié)合的抗體，但也會(huì)去除部分的蛋白，導(dǎo)致蛋白信號(hào)變?nèi)?。我本人?jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)水浴時(shí)有時(shí)溫度不穩(wěn)定，溫度定為 55 度時(shí)往往其溫度容易超過，導(dǎo)致較多的蛋白也被去除，故建議溫度設(shè)為 50 度 30min ，既能有效去除已結(jié)合的抗體，又比 55 度更能保護(hù)蛋白。Strip 時(shí)一定要注意： membrane 一定要完全泡在 strip solution 中（可用較硬的塑料膜封好），然后要完全浸入水中，使受熱均勻 。這一點(diǎn)很重要，要不然，隨后壓出來的總蛋白也好，內(nèi)標(biāo)也好就會(huì)不均一，無法進(jìn)行比較。我曾將同一張membrane 用我提供的方法 strip 了 3 次，分別壓不同的抗體（因?yàn)橛袝r(shí)候蛋白分子量很接近），效果都不錯(cuò)。成都瑞普信生物技術(shù)有限公司第三方檢測慢病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞。重慶凝血四項(xiàng)第三方檢測報(bào)告
GSDME全長蛋白在切割前是沒有活性的，N端和C端結(jié)構(gòu)域之間的分子內(nèi)相互作用調(diào)控自抑制。caspase-3可以將全長GSDME，剪切成有活性的N端（包含1-270a段的GSDME-N）和C端（GSDME-C）。如果需檢測到N端或者C端的GSDME片段，細(xì)胞通常需要誘導(dǎo)處理。在檢測GSDME全長時(shí)需注意，其表達(dá)水平因樣品類型（組織和細(xì)胞）而異，可能在部分組織和細(xì)胞株系表達(dá)，其表達(dá)水平也存在差異，因此需要對(duì)樣品處理和WB實(shí)驗(yàn)進(jìn)行一些優(yōu)化。建議設(shè)置陽性和陰性對(duì)照。并且組織樣本成分更復(fù)雜，在WB實(shí)驗(yàn)時(shí)可能出現(xiàn)多條條帶現(xiàn)象。重慶凝血四項(xiàng)第三方檢測報(bào)告成都第三方檢測基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)，找瑞普信。
“做miRNA下調(diào)，QPCR檢測miRNA，表達(dá)水平無變化”如何解決呢？反義核酸是在轉(zhuǎn)錄后水平發(fā)揮功能，要阻斷miRNA的產(chǎn)生，理想情況是在生成成熟的miRNA之前阻斷。此要求目前唯有CRISPR / Cas9能實(shí)現(xiàn)，Cas9通過在pre-miRNA序列中引入突變，從而破壞miRNA表達(dá)，是miRNA基因功能缺失研究的一種新方法。福建肖老師運(yùn)用Cas9技術(shù)，針對(duì)miR-21基因設(shè)計(jì)sgRNA ，通過慢病毒遞送細(xì)胞，并在RNA水平檢測到mir-21的下調(diào)表達(dá)，從而研究出miR-21耗竭對(duì)CNE2鼻咽（NPC）細(xì)胞生物學(xué)特性及其潛在機(jī)制的影響。使用Cas9敲除miR-21之后，功能上也呈現(xiàn)出陽性，此外，溫醫(yī)大醫(yī)院的張老師使用Cas9敲除mir-545，研究了人環(huán)狀RNA PRKCI（circPRKCI）通過抑制miR-545顯示致性，促進(jìn)人類神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的病理進(jìn)展3。所以，CRISPR / Cas9對(duì)于miRNA的KO是有效的、被認(rèn)可的、且以QPCR檢測表達(dá)量完全沒有問題。
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“做miRNA下調(diào)，QPCR檢測miRNA，表達(dá)水平無變化”，這到底是怎么回事？現(xiàn)有miRNA抑制手段，無論是基于載體構(gòu)建的、還是化學(xué)合成的，本質(zhì)上都是用跟成熟體互補(bǔ)的反義miRNA（miRNA海綿體屬于不完全互補(bǔ)的反義RNA重復(fù)），其可以通過結(jié)合miRNA，阻斷其與靶基因結(jié)合，但并不能有效引發(fā)miRNA的降解，原因有兩方面：其一是反義RNA與miRNA結(jié)合后，序列很短，導(dǎo)致Dicer酶（細(xì)胞內(nèi)降解雙鏈RNA的主角）不能有效結(jié)合；其二是miRNA與Ago2以RISC復(fù)合物的形式存在，該復(fù)合物也會(huì)導(dǎo)致Dicer酶無法高效結(jié)合。因此，如果以反義RNA技術(shù)抑制miRNA功能，QPCR可以做，如果檢測出表達(dá)水平下降還好，即便未檢測到，也不表示抑制無效，正確的做法是直接檢測目的基因蛋白水平是否有上調(diào)。但若實(shí)驗(yàn)者不清楚靶基因的情況下，不檢測到miRNA下調(diào)，心里是沒底的。瑞普信生物技術(shù)有限公司靠譜第三方檢測細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)！重慶凝血四項(xiàng)第三方檢測報(bào)告
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