南京基因編輯技術(shù)脫靶檢測實(shí)驗(yàn)室

CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞對于嵌合抗原受體（Chimericantigenreceptor，CAR）或T細(xì)胞受體（Tcellreceptor，TCR）修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)盡可能采用多種方法評估其靶點(diǎn)相關(guān)毒性和脫靶毒性風(fēng)險(xiǎn)。對于靶點(diǎn)相關(guān)毒性，應(yīng)采用體外方法深入分析靶點(diǎn)在人體qiguan、組織和細(xì)胞中的表達(dá)分布情況，基因表達(dá)分析庫和文獻(xiàn)調(diào)研也可能會有助于闡明靶點(diǎn)在不同病理生理狀態(tài)下的表達(dá)是否存在差異。應(yīng)采用表達(dá)和不表達(dá)靶抗原的細(xì)胞作為靶細(xì)胞進(jìn)行體外試驗(yàn)，確認(rèn)CAR或TCR修飾的免疫細(xì)胞可特異性的識別和殺傷靶細(xì)胞。對于CAR修飾的免疫細(xì)胞，應(yīng)采用多種體外方法評估其胞外抗原識別區(qū)的脫靶風(fēng)險(xiǎn)。脫靶檢測技術(shù)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。南京基因編輯技術(shù)脫靶檢測實(shí)驗(yàn)室

CIRCLE-seq和CHANGE-seq與SITE-seq同期發(fā)表的CIRCLE-seq一定程度上解決了SITE-seq的一些問題。CIRCLE-seq的第一步是將純化后的基因組DNA隨機(jī)打斷成300bp左右的片段，然后首尾相連成環(huán)狀DNA，這種方法很好地避免了DNA隨機(jī)斷裂造成的背景噪聲。實(shí)驗(yàn)的第二步是用Cas9切割環(huán)狀DNA，再連上接頭并進(jìn)行雙端測序，這樣就可以在一次測序中同時(shí)獲取切割位點(diǎn)的兩側(cè)序列，彌補(bǔ)了SITE-seq的另一個(gè)缺點(diǎn)。CIRCLE-seq從總體上來說要優(yōu)于SITE-seq，但是將基因組DNA隨機(jī)打斷后成環(huán)的效率并不高，所以同一作者在3年后發(fā)表了CHANGE-seq，用Tn5一步法打斷基因組并加接頭，提高了成環(huán)效率，降低了起始基因組DNA的用量。南京基因編輯技術(shù)脫靶檢測實(shí)驗(yàn)室種子基因脫靶檢測，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

基因編輯定量脫靶檢測:基因編輯定量脫靶檢測,使用CRISPR/Cas9、ZFNs和TALENs等設(shè)計(jì)核酸酶進(jìn)行基因組編輯，可以將遺傳物質(zhì)定向?qū)氩溉閯游锘蚪M的特定位點(diǎn)。然而，可能會出現(xiàn)非預(yù)期的靶上和靶外基因組修飾，這可能導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定，并破壞正?；虻墓δ埽瑥亩赡軐?dǎo)致臨床前和臨床研究中的安全問題。.基于PCR的檢測唯可生物采用LTA-PCR方法分析基因組編輯引起的靶向和非靶向整合。1.方便地檢測脫靶目標(biāo)變化和隨機(jī)性2.適用于解決監(jiān)管機(jī)構(gòu)提出的具體問題3.定制化生物信息學(xué)分析基于NGS的檢測唯可生物使用靶向富集測序(TES)進(jìn)行全基因組檢測和定量靶向和非靶向改變。我們可在一次反應(yīng)中經(jīng)濟(jì)高效的捕獲所有可能的脫靶事件。1.基于NGS的方法–避免PCR偏倚2.捕獲預(yù)測和非預(yù)測的脫靶事件3.定制生物信息學(xué)分析.

R-loop seq雖然不是一種真正意義上的脫靶位點(diǎn)檢測方法，但能為堿基編輯脫氨酶的脫靶提供一種度量方法，以便于之后的脫氨酶點(diǎn)突變優(yōu)化，來降低脫靶的發(fā)生幾率。2) Detect-seqCRISPR衍生技術(shù)由于其復(fù)雜性，檢測其脫靶位點(diǎn)的hexin思路是捕獲實(shí)驗(yàn)過程中的關(guān)鍵中間產(chǎn)物或者終產(chǎn)物。這種設(shè)計(jì)思路下，目前較為成功的是檢測堿基編輯CBE脫靶位點(diǎn)的Detect-seq[13]。CBE的原理是將dC脫氨變?yōu)閐U，迫使其對側(cè)的dG變?yōu)閐A，較終將堿基對從C-G轉(zhuǎn)變?yōu)門-A。Detect-seq便是針對中間態(tài)的dU，使用Uracil DNA Glycosylase (UDG)，去除U堿基后，替換為帶Biotin的U堿基，捕獲堿基編輯的脫靶位點(diǎn)，并且sgRNA依賴和sgRNA不依賴的脫靶位點(diǎn)都能找到。該方法類似檢測DNA甲基化的重亞硫酸鹽測序法，通過處理特定的堿基，可以捕獲全基因組上的CBE脫靶位點(diǎn)。選擇潛在的脫靶位點(diǎn)，例如選擇gRNA預(yù)測網(wǎng)站上Top 5潛在脫靶位點(diǎn)，進(jìn)行Sanger測序單克??；

TCR修飾免疫細(xì)胞的脫靶毒性可通過評估TCR與人體自身抗原肽的交叉識別能力來評估。首先，應(yīng)采用體外試驗(yàn)測定TCR修飾的免疫細(xì)胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復(fù)合物的親和力，并說明抗原肽的選擇依據(jù)及選擇范圍。此外，還應(yīng)研究其他相關(guān)或不相關(guān)的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應(yīng)可能，應(yīng)確定靶抗原肽的較小識別基序（motif），并采用計(jì)算機(jī)預(yù)測分析評估交叉反應(yīng)性。如果計(jì)算機(jī)預(yù)測可識別出具有潛在交叉反應(yīng)性的抗原肽，應(yīng)在體外測定TCR修飾免疫細(xì)胞對表達(dá)相應(yīng)蛋白或遞呈相應(yīng)抗原肽的的細(xì)胞的識別能力。如果不能排除交叉反應(yīng)性，應(yīng)基于含有潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的蛋白的表達(dá)模式以及TCR與潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的親和力來進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。為獲得TCR與其他等位HLA潛在交叉反應(yīng)性的信息，應(yīng)進(jìn)行充分的HLA交叉反應(yīng)性篩選。對于TCR修飾的T細(xì)胞，還應(yīng)關(guān)注引入TCR鏈和內(nèi)源性TCR之間的錯(cuò)配可能性，應(yīng)描述和說明旨在降低錯(cuò)配可能性的TCR設(shè)計(jì)策略。值得收藏的CRISPR脫靶檢測方法。杭州off-target脫靶檢測評估

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近幾年，細(xì)胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）領(lǐng)域發(fā)展迅猛，在多個(gè)方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA為代的多種CAR-T免疫細(xì)胞療法攻克了一部分血液瘤，多種AAV療法也給一些難以成藥的罕見病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因編輯技術(shù)的眾多基因療法也進(jìn)展迅速，較早體外基因編輯療法較快今年年底能夠上市（CRISPR Therapeutics CTX001），體內(nèi)基因編輯療法取得了不錯(cuò)的臨床數(shù)據(jù)（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技術(shù)制造的通用型CAR-T療法也是免疫細(xì)胞療法發(fā)展的一大趨勢（Caribou Biosciences CB-010）。南京基因編輯技術(shù)脫靶檢測實(shí)驗(yàn)室