南通定量脫靶檢測分析

脫靶來自于這些技術(shù)所攜帶的功能基團(tuán)，如堿基編輯的脫氨酶和先導(dǎo)編輯的逆轉(zhuǎn)錄酶，不依賴sgRNA結(jié)合基因組DNA的情況下產(chǎn)生的脫靶。為檢測第二類脫靶現(xiàn)象，研究者需要針對每種技術(shù)設(shè)計(jì)專門的檢測方法。1) R-loop seq在堿基編輯開發(fā)早期，雖然靶位點(diǎn)的編輯效率很高，但研究者也很快發(fā)現(xiàn)脫氨酶會(huì)在游離的時(shí)候隨機(jī)修飾暴露的DNA單鏈，導(dǎo)致大量的脫靶位點(diǎn)。為降低這類脫靶現(xiàn)象的發(fā)生，研究者設(shè)計(jì)了R-loop seq，以dSaCas9結(jié)合DNA形成R-loop，暴露出DNA單鏈，為堿基編輯的脫氨酶提供一個(gè)固定的脫靶位點(diǎn)，然后以該位點(diǎn)的編輯效率反映堿基編輯脫氨酶的脫靶程度。如何檢測是否發(fā)生脫靶? 基因編輯的脫靶率檢測一般有兩種方法。南通定量脫靶檢測分析

通常不需要進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的遺傳毒性組合試驗(yàn)，但應(yīng)根據(jù)基因zhiliao產(chǎn)品的特點(diǎn)、產(chǎn)品的具體適應(yīng)癥、載體的已有信息、導(dǎo)入基因序列結(jié)構(gòu)等，評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品整合進(jìn)基因組的可能性，判斷是否需要開展另外的遺傳毒性研究，如研究基因組修飾的發(fā)生情況，并檢測隨后可能發(fā)生的異常細(xì)胞行為；評(píng)估插入突變（插入位點(diǎn)、插入拷貝數(shù)等）引起的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品采用基因編輯或轉(zhuǎn)座子技術(shù)時(shí)，需要關(guān)注脫靶編輯、轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)座印跡引起的遺傳毒性問題；鑒定/表征基因組整合位點(diǎn)。定量脫靶檢測技術(shù)值得收藏的CRISPR脫靶檢測方法。

不同基因zhiliao產(chǎn)品的特殊考慮。關(guān)于整合性載體的特殊考慮如受試者接受整合性載體基因zhiliao產(chǎn)品，例如轉(zhuǎn)座子元件、γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒及其他逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，或利用整合性載體或基于轉(zhuǎn)座子的載體在體外修飾的細(xì)胞，長期隨訪中需格外關(guān)注基因zhiliao產(chǎn)品的基因組整合風(fēng)險(xiǎn)，建議申辦方分析基因zhiliao載體在靶細(xì)胞或相關(guān)替代細(xì)胞的基因組中整合的影響（例如是否存在克隆性生長、是否存在優(yōu)勢克隆、克隆性生長是否導(dǎo)致惡性liu等）。如果基因組整合相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)的分析可行，應(yīng)注意以下幾點(diǎn)：?在接受基因zhiliao產(chǎn)品的較初5年內(nèi)，兩次檢測間的采樣間隔建議不超過6個(gè)月。此后每年至少檢測一次，直至檢測數(shù)據(jù)表明不再存在任何安全性風(fēng)險(xiǎn)。

長期隨訪的觀察時(shí)間長期隨訪的持續(xù)時(shí)間應(yīng)確保足以觀察到受試者因產(chǎn)品特性、暴露情況（生物分布和給藥途徑）等導(dǎo)致的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)不短于遲發(fā)性不良反應(yīng)的預(yù)期發(fā)生時(shí)間。一般而言，針對不同類型的基因zhiliao產(chǎn)品建議如下：?具有基因組整合活性的載體（例如γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒載體）和轉(zhuǎn)座子元件建議觀察不短于15年。?可以產(chǎn)生持續(xù)ganran、或有潛伏再jihuo風(fēng)險(xiǎn)的細(xì)菌或病毒載體（如單純皰疹病毒）建議觀察15年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風(fēng)險(xiǎn)（ganran或再jihuo）?；蚓庉嫯a(chǎn)品建議觀察15年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風(fēng)險(xiǎn)。?腺相關(guān)病毒載體建議觀察5年或至數(shù)據(jù)表明不再存在任何風(fēng)險(xiǎn)。定量脫靶檢測，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

細(xì)胞經(jīng)基因修飾后會(huì)改變其生物學(xué)特性，同時(shí)也會(huì)帶來新的安全性風(fēng)險(xiǎn)，如基因編輯脫靶風(fēng)險(xiǎn)、載體插入突變風(fēng)險(xiǎn)、載體重組風(fēng)險(xiǎn)、表達(dá)的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的風(fēng)險(xiǎn)等。在制定非臨床研究計(jì)劃時(shí)，除參考《細(xì)胞zhilliao產(chǎn)品研究與評(píng)價(jià)技術(shù)指導(dǎo)原則》（試行）中的對細(xì)胞zhilliao產(chǎn)品的一般要求外，還應(yīng)具體問題具體分析，基于產(chǎn)品特點(diǎn)和目前已有的科學(xué)認(rèn)知，結(jié)合擬定適應(yīng)癥、患者人群、給藥途徑和給yaofang案等方面的考慮，科學(xué)合理的設(shè)計(jì)和實(shí)施非臨床研究，充分表征產(chǎn)品的藥理學(xué)、毒理學(xué)和藥代動(dòng)力學(xué)特征。在進(jìn)行獲益風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估時(shí)，還應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注由非臨床向臨床過渡時(shí)非臨床研究的局限性和風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測的不確定性。挑選前面的潛在脫靶位點(diǎn)，通過PCR測序驗(yàn)證是否脫靶。定量脫靶檢測技術(shù)

通過對DSB的標(biāo)記實(shí)現(xiàn)了全基因組無偏脫靶檢測，如IDLVs、BLESS、GUIDE-seq技術(shù)等。南通定量脫靶檢測分析

CRISPR/Cas系統(tǒng)是細(xì)菌和古細(xì)菌在不斷進(jìn)化的過程中產(chǎn)生的適應(yīng)性免疫防御機(jī)制，它應(yīng)用CRISPR RNA（crRNA）以堿基互補(bǔ)的形式引導(dǎo)相應(yīng)的Cas蛋白識(shí)別入侵的外源基因組，并對其DNA進(jìn)行剪切，用以保護(hù)自身的基因組免受外源核酸如噬菌體、病毒等的干擾和破壞。經(jīng)過人為改造后，可在真核細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)高度靈活且特異的基因組編輯，通過設(shè)計(jì)特異性向?qū)NA(Single guide RNA, sgRNA)序列與靶序列進(jìn)行堿基配對，從而引導(dǎo)Cas蛋白結(jié)合到靶序列處，行使DNA切割功能，然后利用細(xì)胞的非同源性末端連接(Non-homologous end joining, NHEJ)或同源重組(Homologous recombination,HR)修復(fù)機(jī)制對斷裂的DNA進(jìn)行插入缺失(Indel)、修復(fù)(Repair)或替換(Replacement)。由于其相對于鋅指核酸酶(ZFNs)和轉(zhuǎn)錄jihuo因子樣效應(yīng)物核酸酶(TALENs)技術(shù)更易于操作，而且更高效，因而被廣運(yùn)用于對基因組特定位點(diǎn)進(jìn)行靶向編輯。南通定量脫靶檢測分析