杭州種子基因脫靶檢測guide-sequence

圍繞大家關(guān)心的CRISPR基因編輯安全性問題，我們首先對CRISPR脫靶位點(diǎn)檢測技術(shù)進(jìn)行一次大盤點(diǎn)，在sgRNA設(shè)計(jì)階段需要如何做才能夠盡可能地避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。較簡單的脫靶位點(diǎn)檢測方法是全基因組測序（WGS），但在實(shí)際使用中，即使測序深度達(dá)到100X，也很難發(fā)現(xiàn)一些低頻率的脫靶位點(diǎn)，同時(shí)測序成本卻非常高。為彌補(bǔ)WGS的這些缺陷，常見的脫靶位點(diǎn)檢測技術(shù)都需要對脫靶位點(diǎn)進(jìn)行捕獲富集，來提高檢測靈敏度，降低測序成本。按照實(shí)驗(yàn)原理的不同，脫靶位點(diǎn)檢測技術(shù)可以分為細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和其他特殊方法這3類。脫靶檢測CRO，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。杭州種子基因脫靶檢測guide-sequence

基因zhiliao產(chǎn)品特有的可能會引起遲發(fā)性不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產(chǎn)品可能會采用修飾宿主基因組的技術(shù)，并有可能在宿主細(xì)胞或組織中持續(xù)存在。很多基因zhiliao載體的基因整合不會指向基因組的特定位點(diǎn)，可能在整合位點(diǎn)處產(chǎn)生插入突變、或jihuo整合位點(diǎn)附近的原基因等，進(jìn)而破壞重要基因功能或增加惡性liu的風(fēng)險(xiǎn)，例如，國外已有多項(xiàng)研究報(bào)告在接受了使用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因修飾細(xì)胞zhiliao的受試者中發(fā)生白血病。因此，對于存在此類風(fēng)險(xiǎn)的產(chǎn)品，有必要進(jìn)行長期隨訪臨床研究以評估出現(xiàn)遲發(fā)不良反應(yīng)的風(fēng)險(xiǎn)。廣州高精度脫靶檢測guide-sequence可以與靶基因之外的其他基因作用而非特異性阻斷基因表達(dá),即產(chǎn)生非靶基因的沉默效應(yīng)。

Guide-seq原理圖，Discover-seq細(xì)胞內(nèi)的脫靶切割一般無法直接捕獲，除了Guide-seq這種連接dsODN來間接記錄脫靶位點(diǎn)的方法外，研究者們還想出一種蛋白介導(dǎo)的方法Discover-seq。由于DNA雙鏈斷裂后細(xì)胞會啟動DNA修復(fù)機(jī)制，大量蛋白參與到斷裂處的修復(fù)，所以研究者就對相關(guān)蛋白進(jìn)行篩選，找到其中MRE11結(jié)合DNA的位點(diǎn)與DNA雙鏈斷裂的相關(guān)性比較好。DISCOVER-seq便是通過MRE11的CHIP-seq（染色質(zhì)免疫共沉淀）來反映CRISPR的脫靶位點(diǎn)。。。。

細(xì)胞外檢測方法：細(xì)胞外檢測方法較為直接，將基因組提純后進(jìn)行CRISPR體外切割實(shí)驗(yàn)，再捕獲發(fā)生脫靶切割的位點(diǎn)即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類細(xì)胞外脫靶位點(diǎn)檢測方法，提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后，再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的全基因組測序流程獲得測序數(shù)據(jù)，之后需要較為復(fù)雜的生物信息學(xué)分析才能夠獲得CRISPR切割位點(diǎn)的信息。總體來講，這種方法測序成本較高，并且檢測靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測到低頻脫靶位點(diǎn)，一般需要在建庫時(shí)定向捕獲CRISPR切割位點(diǎn)。SITE-seq就是這樣一種測序方法，提純的基因組DNA經(jīng)過Cas9/sgRNA切割后，在切割位點(diǎn)末端連接帶Biotin的接頭；再隨機(jī)打斷基因組，在另一端連接第二個(gè)接頭；經(jīng)過鏈霉親和素磁珠純化，只有一輪被Cas9切割的DNA才能夠被純化并測序，實(shí)現(xiàn)了CRISPR切割位點(diǎn)的富集。該方法雖然提高了脫靶位點(diǎn)的檢測靈敏度，但有著較高的實(shí)驗(yàn)要求，每次需要投入大量的基因組DNA，并且無法區(qū)分提純基因組DNA時(shí)發(fā)生的隨機(jī)斷裂和Cas9的切割，導(dǎo)致產(chǎn)出較為明顯的背景信號。同時(shí)，由于一輪Biotin接頭只會接在Cas9切割位點(diǎn)的一側(cè)，導(dǎo)致測序結(jié)果里只能看到脫靶位點(diǎn)一側(cè)的序列?；虔煼摪袡z測，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。

TCR修飾免疫細(xì)胞的脫靶毒性可通過評估TCR與人體自身抗原肽的交叉識別能力來評估。首先，應(yīng)采用體外試驗(yàn)測定TCR修飾的免疫細(xì)胞與人自身抗原肽-HLA（與遞呈靶抗原肽的HLA等位基因相同）復(fù)合物的親和力，并說明抗原肽的選擇依據(jù)及選擇范圍。此外，還應(yīng)研究其他相關(guān)或不相關(guān)的蛋白中是否含有靶抗原肽序列。如果TCR與人自身抗原肽有交叉反應(yīng)可能，應(yīng)確定靶抗原肽的較小識別基序（motif），并采用計(jì)算機(jī)預(yù)測分析評估交叉反應(yīng)性。如果計(jì)算機(jī)預(yù)測可識別出具有潛在交叉反應(yīng)性的抗原肽，應(yīng)在體外測定TCR修飾免疫細(xì)胞對表達(dá)相應(yīng)蛋白或遞呈相應(yīng)抗原肽的的細(xì)胞的識別能力。如果不能排除交叉反應(yīng)性，應(yīng)基于含有潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的蛋白的表達(dá)模式以及TCR與潛在交叉反應(yīng)性抗原肽的親和力來進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評估。為獲得TCR與其他等位HLA潛在交叉反應(yīng)性的信息，應(yīng)進(jìn)行充分的HLA交叉反應(yīng)性篩選。對于TCR修飾的T細(xì)胞，還應(yīng)關(guān)注引入TCR鏈和內(nèi)源性TCR之間的錯(cuò)配可能性，應(yīng)描述和說明旨在降低錯(cuò)配可能性的TCR設(shè)計(jì)策略。脫靶(off-target)效應(yīng)是指MicroRNA Agomir/Antagomir可以與特異性互補(bǔ)的核苷酸序列結(jié)合。武漢基因療法脫靶檢測

根據(jù)選擇的sgRNA，通過生物信息學(xué)方法，對sgRNA進(jìn)行脫靶分析。杭州種子基因脫靶檢測guide-sequence

采用基因編輯技術(shù)制備的細(xì)胞產(chǎn)品。對于采用基因編輯技術(shù)制備的基因修飾細(xì)胞產(chǎn)品，應(yīng)進(jìn)行體外在靶和脫靶活性評估，以確認(rèn)修飾酶或向?qū)NA對靶基因序列的特異性。在評估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)時(shí)，應(yīng)說明所選擇的評價(jià)策略的合理性和敏感性。雖然采用計(jì)算機(jī)分析預(yù)測基因編輯的潛在脫靶位點(diǎn)，并對潛在脫靶位點(diǎn)進(jìn)行深度測序分析，可用于評估基因編輯的脫靶風(fēng)險(xiǎn)；但選擇的評價(jià)策略仍應(yīng)包含體外全基因組測序比對，以證明潛在脫靶位點(diǎn)未出現(xiàn)脫靶。此外，在評估脫靶活性時(shí)，還應(yīng)評估種屬特異性的差異、細(xì)胞病理生理狀態(tài)的差異或細(xì)胞類型的差異對非臨床數(shù)據(jù)預(yù)測性的影響。必要時(shí)，還應(yīng)分析基因編輯對細(xì)胞表型和生理功能的潛在影響。杭州種子基因脫靶檢測guide-sequence