室溫培育30min后加入細胞孔板中，置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。2)單克隆細胞篩選轉染24h后胰酶消化細胞并按1∶6比例接種到新6孔板中，同時加入實驗確定的濃度G418，隨后每2d更換一次培養(yǎng)基并維持G418篩選直至單細胞抗性克隆的出現(xiàn)。分別挑選單一抗性克隆至96孔板，待其逐漸增殖后轉入24孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。3)熒光素酶活性鑒定陽性克隆單一抗性克隆傳代至第五代時用LuciferaseAs-sayAystem檢測熒光素酶活性。檢測時，各克隆按1×105個/孔接種到24孔板，24h后細胞裂解液裂解12000rpm，4℃離心10min，收集裂解物，取上清10μl加入96孔白板中，向每孔加入50μl熒光素酶96microplateluminometer連續(xù)讀底物，停留2s后，取10s的熒光值（RLU），每個克隆設3個復孔，保留RLU值高的細胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng)，再過5代后進行熒光素酶活性檢測。保留RLU值維持較高的克隆直至第30代，熒光素酶活性更高的幾個克隆MCF-7-luc即為陽性克隆.各不同數(shù)量細胞克隆的熒光值檢測7-luc陽性克隆細胞按細胞數(shù)將篩出的MCF-4×104、2×104、1×104、5000、2500、1250、625、312和156分別接種到96孔黑板中，另外一組只有細胞，一組只有培養(yǎng)基作對照，設置2個復孔，常規(guī)培去上清并用PBS洗兩次。D-熒光素鉀鹽測試適用范圍包括哪些？熒光生物
4）待圖像分析前，向細胞內(nèi)添加熒光素工作液，37℃孵育5-10min，然后進行圖像分析。2.活ti成像分析1）用無菌的DPBS(w/oMg2+、Ca2+)配制15mg/mL的熒光素的儲存液，混勻。2）用μm濾膜過濾除菌。立即使用，或分裝于-20℃避光保存，避免反復凍融。3）腹腔注射（.），按照150mg/kg的熒光素/體重濃度進行注射，以小鼠為例，每只小鼠體重假定20g，每只小鼠用量3mg；4）注射入體內(nèi)10-15min（待光信號達到更強穩(wěn)定平臺期）后進行成像分析。注：建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線，從而確定更高信號檢測時間和信號平臺期。注意事項1）本品（fireflyluciferin）和甲蟲熒光素（beetleluciferin）、螢光素鉀鹽只是不同別名，以CAS號115144-35-9為準。2）注射方式、動物類型以及體重等都會影響信號的發(fā)射，因此建議每次實驗都要做熒光素酶動力學曲線，確定更佳信號平臺期和更佳的檢測時間。3）如果要進行ATP的檢測，盡量避免外源ATP的污染，如操作時戴手套并使用ATP-free的實驗耗材，在進行熒光素的溶解時應使用ATP-free無菌水。4）為避免反復凍融，本產(chǎn)品配制成溶液后建議適當分裝后-20℃或-80℃保存。為防止氧化，如有條件，可以對儲存液充氮氣或氬氣后保存。熒光增白劑ob-1廠家做D-熒光素鉀鹽的哪家便宜。
LAR）Promega公司推出的第一種螢光素酶檢測試劑LuciferaseAssaySystem（LAR），為靈敏、非放射性的報告基因檢測拉開了序幕。LAR與螢火蟲螢光素酶（luc）報告基因一起，為研究人員開始了解基因表達調(diào)控因子提供了首要的工具。[1]1995Dual-Luciferase?報告基因檢測系統(tǒng)（DLR）DLR是第一種允許在單個樣本中依次檢測兩個報告基因的試劑。通過允許螢光素酶活性的內(nèi)部歸一化，在提高報告基因檢測的可靠性方面取得了關鍵進展。此外，pGL3報告基因載體系列具有改良后的螢火蟲螢光素酶基因，luc+。這個改造一種報告基因以實現(xiàn)性能改進的例子后來被進一步應用到pGL4和luc2報告基因上，通過生物信息學和合成方法，實現(xiàn)了更大的改進。[1]1999ENLITEN?/UltraGlo?重組螢光素酶Promega公司在早期推出的一種重組螢火蟲螢光素酶（Enliten）基礎上，改造出了一種稱為UltraGlo?的熱穩(wěn)定性螢光素酶。UltraGlo?的開發(fā)是在各種檢測和儲藏條件下進行一步法“加樣-讀數(shù)”檢測的關鍵。此后，通過開發(fā)新的方法來改變螢火蟲螢光素酶檢測的信號動力學，例如Bright-Glo?、Steady-Glo?和Dual-Glo?允許使用微孔板進行檢測。而“加樣-讀數(shù)”的形式簡化了樣品處理。
luciferyladenylate）+PPi螢光素化腺苷酸+O2→氧熒光素+AMP+光這一反應非常節(jié)省能量，幾乎所有輸入反應的能量都被轉化為光。與之形成鮮明對比的是人類使用的白熾燈，只有越10%的能量被轉化為光，剩余的能量都變?yōu)闊崮芏焕速M。分析熒光素或熒光素酶不是特定的分子，而是對于所有能夠產(chǎn)生熒光的底物和其對應的酶的統(tǒng)稱，雖然它們各不相同。不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不同的熒光素酶來催化不同的發(fā)光反應。更為人所知的發(fā)光生物是螢火蟲，而其所采用不同的熒光素酶與其他發(fā)光生物如熒光菇（發(fā)光類臍菇，Omphalotusoleariu'）或許多海洋生物都不相同。在螢火蟲中，發(fā)光反應所需的氧氣是從被稱為腹部氣管（abdominaltrachea）的管道中輸入。一些生物，如叩頭蟲，含有多種不同的熒光素酶，能夠催化同一熒光素底物，而發(fā)出不同顏色的熒光。螢火蟲有2000多種，而叩甲總科（包括螢火蟲、叩頭蟲和相關昆蟲）則有更多，因此它們的熒光素酶對于分子系統(tǒng)學研究很有用。目前研究得更透徹的熒光素酶是來自Photinini族螢火蟲中的北美螢火蟲（Photinuspyrali'）。應用熒光素酶可以在實驗室中用基因工程的方法生成，并被用于多種不同的實驗。做D-熒光素鉀鹽測試找哪家公司？
是新型底物開發(fā)的一個早期實例。[1]2012NanoLuc?螢光素酶基于定向進化和新型底物開發(fā)方面的經(jīng)驗，研究人員從蝦的螢光素酶改造設計出一種新型螢光素酶報告基因，即NanoLuc?螢光素酶。這是一種小分子（19kDa）單體酶，具有獨特的底物，其靈敏度比已具備高靈敏度的螢火蟲或海腎螢光素酶系統(tǒng)高約100倍。這種新型的報告基因有著范圍廣的應用前景，為進一步的技術開發(fā)奠定了基礎。[1]2015NanoBRET?技術NanoLuc?的小體積和非常明亮的光輸出是作為蛋白質標簽的理想特征。這些特征還很適合作為生物發(fā)光共振能量轉移（BRET）的供體。一項針對各種能量受體熒光基團的深入研究發(fā)現(xiàn)，紅色光譜中的可選擇性有助于消除與BRET測定相關的一些挑戰(zhàn)。可將這些熒光基團添加到蛋白質配基等分子中以測量靶蛋白的結合，或與HaloTag?配基耦聯(lián)以進行活細胞中蛋白質：蛋白質相互作用的檢測。[1]2016NanoBiT?技術隨著NanoLuc?的誕生，Promega的科學家努力將該報告基因改造為多亞基系統(tǒng)，即“NanoLuc?BinaryTechnology”或NanoBiT?。該系統(tǒng)由兩部分組成：11個氨基酸的小標簽和一個更大，更精細的NanoLuc?亞基，LgBiT。這兩部分結構互補結合。D-熒光素鉀鹽長期保存是有效期一年。揚州熒光素鈉鹽D-熒光素鉀鹽公司
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2）按10μL/g體重的濃度向每支小鼠注射相應量的15mg/mL熒光素溶液；3）腹腔注射10-15min后進行成像分析。（對每只動物模型做熒光素動力學研究以確定峰值信號獲取時間）Firefly,freeacid/D-螢火蟲熒光素分子式：C11H8N2O3S2分子量：g/mol外觀：白色至淺黃色粉末溶解：，形成近乎無色至淺黃色的清夜保存：-15°C避光應用：1）活細胞、組織或生物體內(nèi)luc標記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達的成像分析；2）***用于報告基因分析，免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測分析D-熒光素也常用于體外研究，包括熒光素酶和ATP水平分析；報告基因分析；高通量測序和各種污染檢測。目前有三種產(chǎn)品形式：D-熒光素（游離酸），D-熒光素鹽（鈉鹽和鉀鹽）。主要差別在于溶解特性：前者的水溶性以及緩沖體系的溶解性都較弱，除非溶于弱堿如低濃度NaOH和KOH溶液，可溶于甲醇和DMSO；后者易溶于水或緩沖液中，使用方便，溶劑d0926aa8-0148-40da-80fa-f65性，特別適合體內(nèi)實驗。配成溶液后的這三種產(chǎn)品，在絕大多數(shù)的應用上都沒有實質性的差別。相關列表魯米諾/3-氨基苯二甲酰肼/發(fā)光氨異魯米諾/4-氨基鄰苯二甲酰肼吖啶酯DMAE-NHS吖啶酰肼NSP-SA-ADH吖啶酯ME-DMAE-NHS哌嗪-N,N'-二。熒光生物
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