室溫培育30min后加入細胞孔板中,置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)。2)單克隆細胞篩選轉(zhuǎn)染24h后胰酶消化細胞并按1∶6比例接種到新6孔板中,同時加入實驗確定的濃度G418,隨后每2d更換一次培養(yǎng)基并維持G418篩選直至單細胞抗性克隆的出現(xiàn)。分別挑選單一抗性克隆至96孔板,待其逐漸增殖后轉(zhuǎn)入24孔板中繼續(xù)傳代培養(yǎng)。3)熒光素酶活性鑒定陽性克隆單一抗性克隆傳代至第五代時用LuciferaseAs-sayAystem檢測熒光素酶活性。檢測時,各克隆按1×105個/孔接種到24孔板,24h后細胞裂解液裂解12000rpm,4℃離心10min,收集裂解物,取上清10μl加入96孔白板中,向每孔加入50μl熒光素酶96microplateluminometer連續(xù)讀底物,停留2s后,取10s的熒光值(RLU),每個克隆設3個復孔,保留RLU值高的細胞克隆繼續(xù)傳代培養(yǎng),再過5代后進行熒光素酶活性檢測。保留RLU值維持較高的克隆直至第30代,熒光素酶活性更高的幾個克隆MCF-7-luc即為陽性克隆.各不同數(shù)量細胞克隆的熒光值檢測7-luc陽性克隆細胞按細胞數(shù)將篩出的MCF-4×104、2×104、1×104、5000、2500、1250、625、312和156分別接種到96孔黑板中,另外一組只有細胞,一組只有培養(yǎng)基作對照,設置2個復孔,常規(guī)培去上清并用PBS洗兩次。南京地區(qū)有哪些做D-熒光素鉀鹽測試的公司。免疫化學熒光
從而實時監(jiān)測疾病發(fā)展狀態(tài)或藥物的***功效等。也可以利用ATP對此反應體系的影響,根據(jù)生物發(fā)光強度的變化來指示能量或生命體征。,PotassiumSalt/D-熒光素鉀鹽分子式:NaC11H7N2O3S2·H2O分子量:g/mol純度:高級純()應用:1)活細胞、組織或生物體內(nèi)luc標記基因和熒光素酶-融合基因體內(nèi)/體外表達的成像分析;2)***用于報告基因分析,免疫分析和ATP熒光衛(wèi)生監(jiān)測分析;Protocol1:InVitroBioluminescentAssays/體外生物發(fā)光檢測1)配制成100mM的儲存液(200×,濃度30mg/ml)?;靹蚝罅⒓词褂没蚍盅b后-20℃凍存。2)用預熱好的組織培養(yǎng)基1∶200稀釋儲存液,配制工作液(終濃度150μg/mL)。3)去除培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基直至無殘留。4)圖像分析前立即向細胞內(nèi)添加1×熒光素工作液,然后進行圖像分析(或者細胞放在37℃短時間孵育后檢測可增強信號)。D-熒光素鉀鹽注:螢光素、螢光素酶、螢火蟲螢光素酶、螢光素鉀鹽、螢光素鉀鹽鹽也經(jīng)常被稱作熒光素、熒光素酶、螢火蟲熒光素酶、熒光素鉀鹽、熒光素鈉鹽。Protocol2:Invivoanalysisinmice/小鼠***成像分析1)用無菌的DPBS(w/oMg2+、Ca2+)配制D-熒光素鉀鹽溶液(15mg/mL),。一旦使用,保持冰冷且避光。熒光粉和熒光劑的區(qū)別D-熒光素鉀鹽的配置是什么?
我們將與LgBiT具有極強親和作用的。HiBiT作為一種易于檢測且具有高靈敏度的蛋白質(zhì)標簽,具有多種功能,例如當與基于CRIPSR的標簽一起使用時,可以創(chuàng)建內(nèi)源性報告基因模型。[1]2020Lumit?技術(shù)隨著NanoBiT?技術(shù)的發(fā)展,人們認識到可以利用該系統(tǒng)通過結(jié)合免疫測定的組分檢測多種分析物。由此產(chǎn)生的平臺(現(xiàn)稱為“Lumit”)提供了具有高靈敏度的簡化免疫檢測法。螢光素酶(英語:Luciferase)是自然界中能夠產(chǎn)生生物發(fā)光的酶的統(tǒng)稱,其中**有代表性的是一種學名為Photinuspyralis的螢火蟲體內(nèi)的螢光素酶。在相應化學反應中,熒光的產(chǎn)生是來自于螢光素的氧化,有些情況下反應體系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。沒有螢光素酶的情況下,螢光素與氧氣反應的速率非常慢,而鈣離子的存在常常可以進一步加速反應(與肌肉收縮的情況相似)。螢光生成反應通常分為以下兩步:螢光素+ATP→螢光素化腺苷酸(luciferyladenylate)+PPi螢光素化腺苷酸+O2→氧螢光素+AMP+光這一反應非常節(jié)省能量,幾乎所有輸入反應的能量都被轉(zhuǎn)化為光。與之形成鮮明對比的是人類使用的白熾燈,只有約10%的能量被轉(zhuǎn)化為光,剩余的能量都變?yōu)闊崮芏焕速M。螢光素或螢光素酶不是特定的分子。
其中更有代表性的是一種學名為Photinuspyralis的螢火蟲體內(nèi)的熒光素酶。在相應化學反應中,熒光的產(chǎn)生是來自于螢光素的氧化,有些情況下反應體系中也包括三磷酸腺苷(ATP)。沒有熒光素酶的情況下,螢光素與氧氣反應的速率非常慢,而鈣離子的存在常??梢赃M一步加速反應(與肌肉收縮的情況相似)。[1]熒光生成反應通常分為以下兩步:螢光素+ATP→螢光素化腺苷酸(luciferyladenylate)+PPi螢光素化腺苷酸+O2→氧熒光素+AMP+光這一反應非常節(jié)省能量,幾乎所有輸入反應的能量都被轉(zhuǎn)化為光。與之形成鮮明對比的是人類使用的白熾燈,只有越10%的能量被轉(zhuǎn)化為光,剩余的能量都變?yōu)闊崮芏焕速M。熒光素或熒光素酶不是特定的分子,而是對于所有能夠產(chǎn)生熒光的底物和其對應的酶的統(tǒng)稱,雖然它們各不相同。不同的能夠控制發(fā)光的生物體用不同的熒光素酶來催化不同的發(fā)光反應。更為人所知的發(fā)光生物是螢火蟲,而其所采用不同的熒光素酶與其他發(fā)光生物如熒光菇(發(fā)光類臍菇,Omphalotusolearius)或許多海洋生物都不相同。在螢火蟲中,發(fā)光反應所需的氧氣是從被稱為腹部氣管(abdominaltrachea)的管道中輸入。一些生物,如叩頭蟲,含有多種不同的熒光素酶,能夠催化同一熒光素底物。做D-熒光素鉀鹽測試品牌有哪些?
或分裝于-20℃避光保存,避免反復凍融。2)用預熱好的組織培養(yǎng)基將儲存液稀釋至mg/mL的工作液濃度。3)去除細胞培養(yǎng)基。4)待圖像分析前,向細胞內(nèi)添加熒光素工作液,37℃孵育5-10min,然后進行圖像分析。2.***成像分析1)用無菌的DPBS(w/oMg2+、Ca2+)配制15mg/mL的熒光素的儲存液,混勻。2)用μm濾膜過濾除菌。立即使用,或分裝于-20℃避光保存,避免反復凍融。3)腹腔注射(.),按照150mg/kg的熒光素/體重濃度進行注射。4)注射入體內(nèi)10-15min(待光信號達到更強穩(wěn)定平臺期)后進行成像分析。注:建議對每只動物模型都需要建立熒光素酶動力學曲線,從而確定更高信號檢測時間和信號平臺期。注意事項1)本品(fireflyluciferin)和甲蟲熒光素(beetleluciferin)只只是不同公司在命名上的差異,都是指化合物(S)-2-(6-Hydroxy-2-benzothiazolyl)-2-thiazoline-4-carboxylicacid。2)注射方式、動物類型以及體重等都會影響信號的發(fā)射,因此建議每次實驗都要做熒光素酶動力學曲線,確定更佳信號平臺期和更佳的檢測時間。3)如果要進行ATP的檢測,盡量避免外源ATP的污染,如操作時戴手套并使用ATP-free的實驗耗材,在進行熒光素的溶解時應使用ATP-free無菌水。D-熒光素鉀鹽使用的注意事項。揚州ATPD-熒光素鉀鹽供應商
D-熒光素鉀鹽適用于哪些領(lǐng)域?免疫化學熒光
產(chǎn)品描述D-熒光素(D-Luciferin)是熒光素酶(Luciferase)的常用底物,普遍應用于整個生物技術(shù)領(lǐng)域,特別是體內(nèi)***成像技術(shù)。其作用機制是在ATP和熒光素酶的作用下,熒光素底物能夠被氧化發(fā)光。當熒光素過量時,產(chǎn)生的光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關(guān)性(見下圖)。將攜帶熒光素酶編碼基因(Luc)的慢病毒轉(zhuǎn)染入細胞后構(gòu)建穩(wěn)定表達細胞株,構(gòu)建原位**模型,之后注入熒光素底物,通過IVIS系統(tǒng)來檢測光強度變化,從而實時監(jiān)測疾病發(fā)展狀態(tài)或進行藥物藥效評價等。也可以利用ATP對此反應體系的影響,根據(jù)生物發(fā)光強度的變化來指示能量或生命體征。注:在抗**藥物藥效評價試驗中,由于生物自發(fā)光檢測需要根據(jù)熒光素表達標定**大小,受**生長所發(fā)生的**內(nèi)部壞死影響,生物自發(fā)光并不能很***的評價**生長,在抗**藥效評價有較高要求的實驗中,建議使用小動物核磁成像系統(tǒng)檢測**生長。D-熒光素也常用于體外研究,包括熒光素酶和ATP水平分析;報告基因分析;高通量測序和各種污染檢測。目前有三種產(chǎn)品形式:D-熒光素(游離酸),D-熒光素鹽(鈉鹽和鉀鹽)。主要差別在于溶解特性:前者的水溶性以及緩沖體系的溶解性都較弱,除非溶于弱堿如低濃度NaOH和KOH溶液。可溶于甲醇和DMSO。 免疫化學熒光
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