浙江高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

G0F 抗體在 30 分鐘內(nèi)：半乳糖的存在會影響zhiliao性抗體引發(fā)的效應(yīng)功能，為了研究抗體的作用方式，可能需要徹底去除半乳糖殘留物。Genovis的GalactEXO Immobilized 的 β1-4 半乳糖苷酶活性在曲妥珠單抗上使用 30 分鐘孵育證明。genovis的GalactEXO Immobilized 由強(qiáng)大的 GalactEXO 酶組成，該酶固定在瓊脂糖珠上，并以易于使用的微離心柱形式格式化。GalactEXO是β-半乳糖苷酶的混合物，可有效去除N-和O-糖基化蛋白上的半乳糖殘基。使用FabRICATOR?將抗體消化成亞基，并使用LC-MS進(jìn)行分析。使用 GalactEXO 凍干和 GalactEXO 固定化都可以看到向 G0F 糖型的轉(zhuǎn)變，但后者在z終制劑中沒有留下酶。沒有任何半乳糖基化結(jié)構(gòu)表明半乳糖殘基完全水解，因此LC-MS數(shù)據(jù)中任何剩余的次要峰都可以注釋為亞基的糖化。沒有任何半乳糖基化結(jié)構(gòu)表明半乳糖殘基完全水解，因此LC-MS數(shù)據(jù)中任何剩余的次要峰都可以注釋為亞基的糖化。曲妥珠單抗Fc N-糖可以表征游離N-糖以及去糖基化抗體的功能和結(jié)構(gòu)。浙江高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

糖蛋白性能測試：O-聚糖的巖藻糖基化參與功能上重要的聚糖表位的合成，例如血型抗原和劉易斯結(jié)構(gòu)。分析用這種復(fù)雜的聚糖結(jié)構(gòu)修飾的糖蛋白可能具有挑戰(zhàn)性，需要高效和特異性的酶工具。我們在許多糖基工程TNFR蛋白上測試了Genovis的FucosEXO，這些蛋白攜帶多達(dá)11個(gè)O-聚糖，這些O-聚糖以不同的鍵裝飾。我們將該活性與其他市售巖藻苷酶進(jìn)行了比較。FucosEXO 能夠在 1 小時(shí)內(nèi)對所有三種 TNFR 蛋白進(jìn)行去巖藻糖磺酸處理，而用其他巖藻糖酶處理導(dǎo)致部分去除巖藻糖或根本沒有去除。安徽N-聚糖水解酶PNGaseF去糖基化酶生物藥物開發(fā)FucosEXO凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在2000單位的小瓶中，用于2mg糖蛋白的去碳基化。

在Genovis的PNGaseF去除N-聚糖并用SialEXO和GalactEXO截?cái)郞-聚糖后，在質(zhì)譜圖中觀察到幾個(gè)與GalNAcs相關(guān)的峰。為了去除剩余的GalNAc殘基，應(yīng)用GalNAcEXO酶。用GalNAcEXO處理后觀察到的單個(gè)蛋白峰顯示完全去除剩余的GalNAcs。?GalNAcEXO在生理緩沖液和中性pH值中具有活性，使其與大多數(shù)樣品相容。此外，GalNAcEXO的活性不依賴于任何可能影響LC-MS分析的輔因子，如BSA。根據(jù)底物的性質(zhì)，糖蛋白的GalNAcEXO反應(yīng)在2小時(shí)內(nèi)完成，而更復(fù)雜的樣品可能需要孵育過夜。Genovis的GalNAcEXO也可固定在離心柱中，以便快速方便地處理樣品，在制備過程中不會殘留酶。

使用Genovis的GalNAcEXO 對 O-糖基化生物制藥進(jìn)行 Tn 抗原表征：未成熟的截短O-聚糖導(dǎo)致了復(fù)雜生物制藥的異質(zhì)性，使其分析更具挑戰(zhàn)性。 O-聚糖的he心由n-α-GalNAc殘基組成，通過糖苷鍵與絲氨酸或蘇氨酸連接，稱為Tn抗原。 現(xiàn)在，使用GalNAcEXO可以采用合適的酶策略來去除這些GalNAc并簡化生物制藥的表征。在質(zhì)譜圖中可以觀察到重復(fù)峰的模式。其次，在與GalNAcEXO酶孵育后，剩余的GalNAc殘基被完全去除，留下一個(gè)峰。因此，該工作流程確認(rèn)了 O-糖基化生物制藥上存在 Tn 抗原，并允許定量he心 GalNAc 水平。這種工作流程的另一個(gè)好處是減少了剩余的異質(zhì)性，這有助于確認(rèn)蛋白質(zhì)的完整質(zhì)量，并揭示截短的片段。對游離的N-聚糖的分析表明，SialEXO在溶液中完全脫唾液酸化。

Genvois的SialEXO產(chǎn)品是唾液酸酶，用于N-和O-糖基化蛋白的有效去唾液酸化。SialEXO凍干由兩種唾液酸酶組成，每種唾液酸酶都具有獨(dú)特的活性，并且它們同時(shí)起作用。一種酶對α2-3、α2-6和α2-8連接的唾液酸具有很好的活性，另一種酶（SialEXO 2-3）通過α2-3-鍵快速水解唾液酸。SialEXO凍干可在2小時(shí)內(nèi)去除天然蛋白質(zhì)上的所有唾液酸。SialEXO在天然條件下水解糖蛋白，在pH值范圍為6.5至9時(shí)顯示出活性。這些酶來源于Akkermansia muciniphila，并在大腸桿菌中表達(dá)。兩種酶都含有 His 標(biāo)簽，酶的分子量為 43 kDa 和 66 kDa。 GalactEXO 凍干劑以凍干粉的形式提供，裝在 2000 單位小瓶中，用于在 2 mg 糖蛋白上水解 β1-3,4-連接的半乳糖。吉林PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

在天然條件下使用OmniGLYZOR Microspin色譜柱，可在3小時(shí)內(nèi)有效去除C1 抑制劑O-聚糖。浙江高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究

當(dāng)在完整狀態(tài)下進(jìn)行分析時(shí)，EPO的聚糖異質(zhì)性導(dǎo)致了非常復(fù)雜的質(zhì)譜圖。通過在 37°C 下在 OmniGLYZOR Microspin 柱上孵育 1 小時(shí)，可以有效地去除 N 糖（含有PNGase F酶）和 O-糖，如對應(yīng)于未修飾蛋白質(zhì)的單個(gè)峰所示。EPO上殘留了少量用乙?；僖核嵝揎椀腛-聚糖，因?yàn)镺mniGLYZOR對這種結(jié)構(gòu)的水解效率低下。根據(jù)制造商Genvois的建議（在37°C下進(jìn)行O/N孵育），兩種底物蛋白也用另一種市售的去糖基化產(chǎn)物處理，并顯示數(shù)據(jù)以供比較。另一方面，N-聚糖在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中翻譯地連接到未折疊的蛋白質(zhì)上。這導(dǎo)致某些 N-糖基化位點(diǎn)難以被 Genovis的PNGase F 接近，或者一旦底物蛋白折疊成其天然狀態(tài)，就根本無法接近。因此，這種N-聚糖的水解需要底物蛋白以與酶活性相容的方式變性。浙江高活性/無非特異酶活PNGaseF去糖基化酶疾病機(jī)理研究