廣東疫苗產(chǎn)品用宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)抗體覆蓋率驗(yàn)證

湖州申科生物致力于開(kāi)發(fā)接近實(shí)際工藝的商業(yè)化宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)試劑盒，通過(guò)不同工藝的HCP差異化分析，針對(duì)性輸出不同細(xì)分工藝領(lǐng)域的HCP檢測(cè)試劑盒。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明：針對(duì)CHO-S與CHO-K1兩種宿主細(xì)胞，二者共享2458種共同HCP（占比79.7%），但分別存在392種與236種特異HCP，凸顯工藝差異導(dǎo)致的殘留蛋白特異性。進(jìn)一步對(duì)比B3表達(dá)菌與K2克隆菌，二者雖共享1489種相同蛋白（占比88%和85%），但仍分別檢出208種和258種獨(dú)有蛋白，差異率達(dá)12%-15%。這些發(fā)現(xiàn)直接驗(yàn)證不同工藝路線與克隆選擇會(huì)影響HCP殘留譜的組成。因此，湖州申科提出"工藝定制化檢測(cè)"策略——通過(guò)準(zhǔn)確識(shí)別共性及特異HCP，針對(duì)性開(kāi)發(fā)細(xì)分試劑盒產(chǎn)品。

湖州申科采用免疫磁珠分離（IMBS）結(jié)合 2D 電泳或者 LC-MS 的方法評(píng)估抗體覆蓋率。IMBS主要流程包括多克隆抗體與磁珠偶聯(lián)，磁珠未結(jié)合位點(diǎn)的封閉，HCP樣本與結(jié)合抗體的磁珠共同孵育，此過(guò)程中 HCP 抗體結(jié)合可以識(shí)別的 HCP，而未識(shí)別的 HCP 則通過(guò)后續(xù)洗滌步驟去除，再通過(guò)低 pH等洗脫條件收集抗體捕獲的HCP。該方法擁有 AAE(Antibody Affinity Extraction)免疫層析柱分離的所有優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)免疫磁珠可以在懸浮的條件下與 HCP樣品充分混勻結(jié)合，HCP結(jié)合效果更佳，由于采用磁珠吸附可以減少 HCP與填料的非特異性吸附，提高實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)確性。

SHENTEK^®AbunProteoX是一種基于磁珠構(gòu)建的親和配體，適用于各類生物制品樣本，操作流程經(jīng)過(guò)精心設(shè)計(jì)，簡(jiǎn)化而高效，便于用戶實(shí)施。與傳統(tǒng)的非變性酶解方法相比，AbunProteoX能夠顯著提高了HCP的檢出，有效增強(qiáng)了質(zhì)譜分析的檢測(cè)下限，使得低豐度蛋白得以被有效檢出，確保了檢測(cè)的高靈敏度。即使在高豐度目標(biāo)蛋白存在的情況下，經(jīng)過(guò)AbunProteoX處理，仍可有效地分析HCPs，為生物制品中宿主細(xì)胞蛋白殘留控制提供了一個(gè)簡(jiǎn)便、易于使用和有力的樣品處理工具。

宿主細(xì)胞蛋白通常是與重要細(xì)胞功能相關(guān)的蛋白，如細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡等，在工藝過(guò)程中分泌或因細(xì)胞死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過(guò)程中，以下幾個(gè)因素會(huì)主要影響HCP的組成和豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在的HCP數(shù)量可能非常大，且非所有基因都表達(dá)，某些基因在不同的時(shí)間和條件下表達(dá)；如大腸桿菌約4300個(gè)基因，不同的工藝產(chǎn)物會(huì)經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，增加了HCP的總數(shù)和生化復(fù)雜性。有研究表明，如大腸桿菌表達(dá)的蛋白，其不同蛋白之間存在數(shù)量差異，這些差異可能是對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但大多數(shù) (85-90%) 有潛在免疫原性的宿主細(xì)胞蛋白在不同的發(fā)酵過(guò)程中都會(huì)出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體和輔助成分組成的體系可以穩(wěn)定、瞬時(shí)和誘導(dǎo)表達(dá)；如大腸桿菌常見(jiàn)的表達(dá)形式有胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性的包涵體形式，以及融合和非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品本身的特性的影響：純化過(guò)程中大部分的HCP被去除(>99％)，殘留的HCP仍保留在產(chǎn)品中，可能與產(chǎn)品共結(jié)合，一起被純化。

宿主細(xì)胞殘留蛋白（HCP）檢測(cè)是生物制品質(zhì)量控制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，采用基于抗體的免疫學(xué)方法（如ELISA）。然而，不同試劑盒之間的檢測(cè)結(jié)果常存在明顯差異，關(guān)鍵原因在于其依賴的關(guān)鍵組分——HCP校準(zhǔn)品和檢測(cè)抗體——本身制備與表征的高度可變性。校準(zhǔn)品作為定量的基準(zhǔn)，其復(fù)雜性極大。不同供應(yīng)商在制備時(shí)使用的細(xì)胞來(lái)源、培養(yǎng)及表達(dá)條件、宿主蛋白提取純化工藝（例如目標(biāo)產(chǎn)物去除策略）差異明顯，導(dǎo)致校準(zhǔn)品的組成、代表性及穩(wěn)定性各不相同。同樣，檢測(cè)抗體（尤其是多抗）通過(guò)免疫動(dòng)物獲得，其特異性與覆蓋度受免疫原、動(dòng)物應(yīng)答個(gè)體差異、免疫方案及后續(xù)抗體篩選/純化過(guò)程的影響巨大，不同批次或來(lái)源抗體的識(shí)別譜（如對(duì)不同HCP的親和力、對(duì)低豐度蛋白的靈敏度）存在本質(zhì)差別。正是這些關(guān)鍵組分固有的明顯變異度，導(dǎo)致不同試劑盒對(duì)同一樣本的檢測(cè)結(jié)果在數(shù)值上、甚至特定HCP的檢出能力上可能出現(xiàn)較大偏差。因此，為確保檢測(cè)結(jié)果真實(shí)反映自身產(chǎn)品的HCP殘留情況，企業(yè)應(yīng)結(jié)合自身產(chǎn)品特性和工藝，對(duì)不同試劑盒進(jìn)行詳細(xì)的平行比對(duì)與適用性評(píng)估，以篩選出匹配度較高的檢測(cè)方案。

湖州申科生物通過(guò)自主可控的供應(yīng)鏈體系與嚴(yán)格驗(yàn)證的技術(shù)性能，確保HCP檢測(cè)試劑盒的長(zhǎng)期穩(wěn)定供應(yīng)與優(yōu)異的分析能力。一方面，公司實(shí)現(xiàn)了關(guān)鍵物料的自研自產(chǎn)：校準(zhǔn)品采用凍干工藝大規(guī)模制備，可穩(wěn)定保存10年以上；抗體通過(guò)大動(dòng)物免疫獲得，產(chǎn)量可滿足≥10,000盒試劑盒的生產(chǎn)需求，保障同批次抗體持續(xù)供應(yīng)超過(guò)10年；試劑盒經(jīng)多批次驗(yàn)證顯示良好的批內(nèi)與批間一致性。另一方面，所有產(chǎn)品參考ICH Q2（R2）和ICH M10法規(guī)要求完成驗(yàn)證：以E.coli HCP產(chǎn)品為例，其線性范圍（243-1 ng/mL）的R2>0.999，各濃度點(diǎn)回收率偏差≤5%；準(zhǔn)確度達(dá)81.2%-111.6%，中間精密度CV值5.7%-12.4%；LLOQ低至1.5 ng/mL，且對(duì)多種宿主細(xì)胞（如CHO、HEK293等）的交叉反應(yīng)均低于檢測(cè)限。同時(shí)，通過(guò)二維電泳（檢出826個(gè)蛋白點(diǎn)）與質(zhì)譜法（鑒定2204個(gè)蛋白點(diǎn)）雙重表征校準(zhǔn)品，并采用IMBS-2D（>70%）與IMBS-MS（84.7%）正交技術(shù)驗(yàn)證抗體覆蓋率，從源頭確保檢測(cè)結(jié)果的全面性與可靠性。