上海定制化宿主細(xì)胞蛋白（HCP）殘留檢測(cè)抗體覆蓋率驗(yàn)證

宿主細(xì)胞蛋白通常是與重要細(xì)胞功能相關(guān)的蛋白，如細(xì)胞增殖、基因轉(zhuǎn)錄、蛋白合成修飾、細(xì)胞存活、細(xì)胞凋亡等，在工藝過(guò)程中分泌或因細(xì)胞死亡或裂解而釋放。生產(chǎn)過(guò)程中，以下幾個(gè)因素會(huì)主要影響HCP的組成和豐度：①宿主細(xì)胞基因組調(diào)控及培養(yǎng)工藝：特定工藝下，潛在的HCP數(shù)量可能非常大，且非所有基因都表達(dá)，某些基因在不同的時(shí)間和條件下表達(dá)；如大腸桿菌約4300個(gè)基因，不同的工藝產(chǎn)物會(huì)經(jīng)歷獨(dú)特的翻譯后修飾，增加了HCP的總數(shù)和生化復(fù)雜性。有研究表明，如大腸桿菌表達(dá)的蛋白，其不同蛋白之間存在數(shù)量差異，這些差異可能是對(duì)環(huán)境條件的適應(yīng)性反應(yīng)，但大多數(shù) (85-90%) 有潛在免疫原性的宿主細(xì)胞蛋白在不同的發(fā)酵過(guò)程中都會(huì)出現(xiàn)。②產(chǎn)物表達(dá)方式：宿主細(xì)胞與外源基因、載體和輔助成分組成的體系可以穩(wěn)定、瞬時(shí)和誘導(dǎo)表達(dá)；如大腸桿菌常見(jiàn)的表達(dá)形式有胞內(nèi)表達(dá)、分泌表達(dá)、可溶性表達(dá)、不溶性的包涵體形式，以及融合和非融合表達(dá)。③純化步驟及產(chǎn)品本身的特性的影響：純化過(guò)程中大部分的HCP被去除(>99％)，殘留的HCP仍保留在產(chǎn)品中，可能與產(chǎn)品共結(jié)合，一起被純化。

湖州申科在宿主細(xì)胞蛋白（HCP）ELISA檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域擁有深厚的積累，已成功構(gòu)建高質(zhì)量、全流程的自有開(kāi)發(fā)平臺(tái)，覆蓋HCP檢測(cè)試劑盒研發(fā)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①抗原表征與制備：基于合規(guī)平臺(tái)的HCP Reference/Antigen制備能力，采用2D凝膠電泳等先進(jìn)技術(shù)確?？乖瓗?kù)的代表性。②動(dòng)物免疫與抗體制備：依托自有免疫動(dòng)物平臺(tái)，控制免疫原設(shè)計(jì)與動(dòng)物免疫過(guò)程，產(chǎn)出高特異性、廣覆蓋度的抗體。③體系開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證：憑借成熟的技術(shù)經(jīng)驗(yàn)開(kāi)發(fā)高靈敏度、高穩(wěn)定性的檢測(cè)體系，并嚴(yán)格遵循GMP標(biāo)準(zhǔn)完成方法學(xué)驗(yàn)證。該平臺(tái)通過(guò)全流程自主可控的技術(shù)整合，從源頭保證試劑盒性能的一致性與可靠性，明顯降低不同批次試劑盒的檢測(cè)變異性。其研發(fā)的HCP ELISA試劑盒已成功服務(wù)于國(guó)內(nèi)外200余家生物醫(yī)藥企業(yè)，為生物制品（如單抗、疫苗）的工藝開(kāi)發(fā)、質(zhì)量控制及法規(guī)申報(bào)（如IND/BLA）提供符合監(jiān)管要求的定制化檢測(cè)解決方案。

為了更好地控制工藝和保證產(chǎn)品質(zhì)量的穩(wěn)定，各國(guó)監(jiān)管機(jī)構(gòu)均要求提供使用的宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)ELISA試劑盒的抗體覆蓋率數(shù)據(jù)。一般需進(jìn)行覆蓋率分析的場(chǎng)景一般有以下幾種情況：①臨床II期后，若是繼續(xù)使用商品化試劑盒，則需要評(píng)估試劑盒抗體覆蓋率是否可以繼續(xù)用于質(zhì)量監(jiān)控；②臨床III期及以后階段，產(chǎn)品研究者開(kāi)發(fā)了平臺(tái)化或工藝專屬型的HCP監(jiān)測(cè)方法，該類試劑盒在使用前要評(píng)估覆蓋率水平與商業(yè)化覆蓋水平的差異；③申報(bào)時(shí)沒(méi)有提交覆蓋率數(shù)據(jù)，監(jiān)管機(jī)構(gòu)可能會(huì)對(duì)企業(yè)提出發(fā)補(bǔ)的要求；④產(chǎn)品上市后發(fā)生了包括生產(chǎn)場(chǎng)地變更，工藝變更，HCP分析方法變更等因素的變更，研究者則需要評(píng)估變更前后抗體覆蓋率水平的差異，以及該差異對(duì)藥品質(zhì)量與安全帶來(lái)的影響。

LC-MS技術(shù)作為生物制品宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)新趨勢(shì)，需考慮以下幾點(diǎn)：①穩(wěn)定性：需要HCPs LC-MS檢測(cè)流程進(jìn)行驗(yàn)證，全流程都需要有嚴(yán)格的QC控制，確保檢測(cè)結(jié)果的一致性和穩(wěn)定性。②可重復(fù)性：不同類型生物制品中HCPs提取效率不同，不同人員操作存在差異，需要在上機(jī)前通過(guò)不同方法評(píng)估HCPs的提取效率，避免人為因素造成結(jié)果重復(fù)性差。③準(zhǔn)確度：方法開(kāi)發(fā)與驗(yàn)證階段，通過(guò)設(shè)立內(nèi)標(biāo)與定量算法，根據(jù)內(nèi)標(biāo)響應(yīng)回算得到HCPs的含量，確保定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。④抗干擾能力：高豐度蛋白和特殊基質(zhì)會(huì)對(duì)質(zhì)譜檢測(cè)產(chǎn)生影響，需要通過(guò)前處理手段對(duì)高豐度蛋白或特殊的基質(zhì)進(jìn)行去除，以減少其對(duì)HCPs肽段在質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)的影響。⑤真實(shí)性：樣品中除HCPs以外的物質(zhì)在質(zhì)譜分析中同樣會(huì)產(chǎn)生質(zhì)譜信號(hào)，需要去除復(fù)雜的背景噪音避免假陽(yáng)性和假陰性的出現(xiàn)，建立合理標(biāo)準(zhǔn)的生信分析流程。分析流程建立過(guò)程中同樣需要建立嚴(yán)格的質(zhì)控QC標(biāo)準(zhǔn)，并通過(guò)后期不同方法進(jìn)行驗(yàn)證，確定其標(biāo)準(zhǔn)的真實(shí)性。

為什么定制化試劑盒是宿主細(xì)胞蛋白殘留檢測(cè)的優(yōu)先選擇？這與檢測(cè)準(zhǔn)確性和藥物安全性密切相關(guān)。HCP ELISA 檢測(cè)作為多分析物檢測(cè)方法，其結(jié)果準(zhǔn)確性高度依賴校準(zhǔn)品、抗體質(zhì)量及檢測(cè)方法建立。定制化 HCP ELISA 檢測(cè)試劑盒的關(guān)鍵優(yōu)勢(shì)在于，它基于更具代表性的 HCP 抗原免疫動(dòng)物，由此產(chǎn)生的 HCP 抗體針對(duì)性更強(qiáng)。這種針對(duì)性抗體能極大降低 HCP 漏檢風(fēng)險(xiǎn)，尤其對(duì)生產(chǎn)工藝中特有的高風(fēng)險(xiǎn) HCP 因子，展現(xiàn)出更優(yōu)的檢出效果，為藥物的安全有效和質(zhì)量可控提供有力保障。

湖州申科生物CHO-K1 HCP 殘留檢測(cè)試劑盒（一步酶聯(lián)免疫吸附法）基于固相酶聯(lián)免疫吸附分析法，適用于基于CHO-K1細(xì)胞生產(chǎn)的生物制品中宿主殘留蛋白的定量檢測(cè)。該分析方法通過(guò)在預(yù)包被抗CHO-K1HCPs綿羊多抗的酶標(biāo)板中加入校準(zhǔn)品或待測(cè)樣品、HRP標(biāo)記的抗CHO-K1HCPs綿羊多抗進(jìn)行共孵育。洗滌后，加入TMB底物進(jìn)行顯色反應(yīng)，再使用終止液終止酶催化反應(yīng)。利用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)讀吸光度，其吸光度與校準(zhǔn)品或待測(cè)樣品中的HCPs濃度成正相關(guān)，通過(guò)校準(zhǔn)品擬合的劑量-反應(yīng)曲線即可計(jì)算得出待測(cè)樣品中HCPs的濃度。本試劑盒對(duì)待測(cè)樣品無(wú)需進(jìn)行特殊處理，只需通過(guò)合適的稀釋比例進(jìn)行適用性驗(yàn)證即可直接使用。本試劑盒操作步驟少，快速，檢測(cè)專一性強(qiáng)，性能穩(wěn)定可靠。