浙江基因療法脫靶檢測評估

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-05-17

對基于慢病毒/逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的基因zhiliao產(chǎn)品,如出現(xiàn)與可復(fù)制xingbing毒可能相關(guān)的不良事件,還應(yīng)開展可復(fù)制xingbing毒(replicablecompetentlentivirus/retrovirus,RCL/RCR)的檢測。關(guān)于基因編輯產(chǎn)品的特殊考慮基因編輯產(chǎn)品除了適用基因zhiliao產(chǎn)品的一般考慮以及整合性載體的特殊考慮外,長期隨訪中還應(yīng)額外關(guān)注脫靶風(fēng)險(xiǎn),量化評估脫靶活性和在靶活性之間的相關(guān)性,或利用在靶活性來預(yù)測脫靶活性的水平。如果基因zhiliao產(chǎn)品通過全身給yaofang式遞送,長期隨訪中的安全性監(jiān)測不僅包括靶qiguan或靶組織的脫靶活性,而且還應(yīng)包括可能發(fā)生在其他組織和qiguan中的脫靶活性。如何檢測是否發(fā)生脫靶? 基因編輯的脫靶率檢測一般有兩種方法。浙江基因療法脫靶檢測評估

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圍繞大家關(guān)心的CRISPR基因編輯安全性問題,我們首先對CRISPR脫靶位點(diǎn)檢測技術(shù)進(jìn)行一次大盤點(diǎn),在sgRNA設(shè)計(jì)階段需要如何做才能夠盡可能地避免脫靶現(xiàn)象的發(fā)生。較簡單的脫靶位點(diǎn)檢測方法是全基因組測序(WGS),但在實(shí)際使用中,即使測序深度達(dá)到100X,也很難發(fā)現(xiàn)一些低頻率的脫靶位點(diǎn),同時(shí)測序成本卻非常高。為彌補(bǔ)WGS的這些缺陷,常見的脫靶位點(diǎn)檢測技術(shù)都需要對脫靶位點(diǎn)進(jìn)行捕獲富集,來提高檢測靈敏度,降低測序成本。按照實(shí)驗(yàn)原理的不同,脫靶位點(diǎn)檢測技術(shù)可以分為細(xì)胞外、細(xì)胞內(nèi)和其他特殊方法這3類。南京脫靶檢測方法種子基因脫靶檢測多少錢?

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細(xì)胞外檢測方法:細(xì)胞外檢測方法較為直接,將基因組提純后進(jìn)行CRISPR體外切割實(shí)驗(yàn),再捕獲發(fā)生脫靶切割的位點(diǎn)即可。1) Digenome-seqDigenome-seq是較早提出的一類細(xì)胞外脫靶位點(diǎn)檢測方法,提純的基因組DNA被Cas9/sgRNA切割后,再經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)的全基因組測序流程獲得測序數(shù)據(jù),之后需要較為復(fù)雜的生物信息學(xué)分析才能夠獲得CRISPR切割位點(diǎn)的信息??傮w來講,這種方法測序成本較高,并且檢測靈敏度也有限。2)SITE-seq為了有效檢測到低頻脫靶位點(diǎn),一般需要在建庫時(shí)定向捕獲CRISPR切割位點(diǎn)。SITE-seq就是這樣一種測序方法,提純的基因組DNA經(jīng)過Cas9/sgRNA切割后,在切割位點(diǎn)末端連接帶Biotin的接頭;再隨機(jī)打斷基因組,在另一端連接第二個(gè)接頭;經(jīng)過鏈霉親和素磁珠純化,只有一輪被Cas9切割的DNA才能夠被純化并測序,實(shí)現(xiàn)了CRISPR切割位點(diǎn)的富集。該方法雖然提高了脫靶位點(diǎn)的檢測靈敏度,但有著較高的實(shí)驗(yàn)要求,每次需要投入大量的基因組DNA,并且無法區(qū)分提純基因組DNA時(shí)發(fā)生的隨機(jī)斷裂和Cas9的切割,導(dǎo)致產(chǎn)出較為明顯的背景信號。同時(shí),由于一輪Biotin接頭只會接在Cas9切割位點(diǎn)的一側(cè),導(dǎo)致測序結(jié)果里只能看到脫靶位點(diǎn)一側(cè)的序列。

檢測方法的敏感度、特異性和可重復(fù)性應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證,并設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ眨划?dāng)體內(nèi)靶細(xì)胞或替代細(xì)胞中載體序列陽性的比例超出預(yù)期范圍時(shí),應(yīng)開展克隆性生長的評估。如果存在優(yōu)勢克隆或單克隆生長,應(yīng)在不超過3個(gè)月的時(shí)間內(nèi)再次檢測確認(rèn),并盡快開展整合位點(diǎn)的分析。當(dāng)載體的整合位點(diǎn)確定后,應(yīng)與人類基因組數(shù)據(jù)庫及基因組的其他數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行比較,確定整合位點(diǎn)的基因功能,評估是否與包括zheng在內(nèi)的任何疾病有關(guān)。如果受試者體內(nèi)出現(xiàn)載體陽性細(xì)胞的克隆性生長,或檢測發(fā)現(xiàn)基因整合位點(diǎn)在基因或相關(guān)基因附近,應(yīng)縮短檢測間隔至不超過3個(gè)月并密切監(jiān)測惡性liu征兆,直至檢測不到基因zhiliao載體。隨著脫靶影響因素、降低策略及脫靶檢測技術(shù)研究的不斷深入,未來CRISPR/Cas9系統(tǒng)將在更多領(lǐng)域造福人類。

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脫靶來自于這些技術(shù)所攜帶的功能基團(tuán),如堿基編輯的脫氨酶和先導(dǎo)編輯的逆轉(zhuǎn)錄酶,不依賴sgRNA結(jié)合基因組DNA的情況下產(chǎn)生的脫靶。為檢測第二類脫靶現(xiàn)象,研究者需要針對每種技術(shù)設(shè)計(jì)專門的檢測方法。1) R-loop seq在堿基編輯開發(fā)早期,雖然靶位點(diǎn)的編輯效率很高,但研究者也很快發(fā)現(xiàn)脫氨酶會在游離的時(shí)候隨機(jī)修飾暴露的DNA單鏈,導(dǎo)致大量的脫靶位點(diǎn)。為降低這類脫靶現(xiàn)象的發(fā)生,研究者設(shè)計(jì)了R-loop seq,以dSaCas9結(jié)合DNA形成R-loop,暴露出DNA單鏈,為堿基編輯的脫氨酶提供一個(gè)固定的脫靶位點(diǎn),然后以該位點(diǎn)的編輯效率反映堿基編輯脫氨酶的脫靶程度。脫靶檢測guide-sequence,推薦唯可生物,實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng),專業(yè)性高,檢測效率高,結(jié)果準(zhǔn)確率高。南京脫靶檢測方法

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脫落與傳播。對于部分有g(shù)anran或復(fù)制能力的基因zhiliao產(chǎn)品,從受試者者體內(nèi)排出或脫落到自然環(huán)境后,可能會傳播給受試者的密切接觸者,包括患者親屬和醫(yī)護(hù)人員等,進(jìn)而產(chǎn)生病毒傳播或ganran風(fēng)險(xiǎn)。其他考慮因素。除產(chǎn)品相關(guān)因素外,基因zhiliao產(chǎn)品的長期風(fēng)險(xiǎn)評估還應(yīng)考慮靶細(xì)胞/組織/qiguan,患者群體(年齡、免疫狀態(tài)、死亡風(fēng)險(xiǎn)等)和相關(guān)疾病的特征以及合并其他zhiliao的影響。如果基因zhiliao產(chǎn)品可在生殖腺、生殖細(xì)胞等組織qiguan中分布并發(fā)揮作用,可能對受試者或其配偶的生育能力、妊娠以及胎兒產(chǎn)生難以預(yù)測的遲發(fā)性影響。浙江基因療法脫靶檢測評估