蘇州脫靶檢測安全性評價

近幾年，細(xì)胞和基因zhiliao（cell & gene therapy，CGT）領(lǐng)域發(fā)展迅猛，在多個方向取得了重大突破，以anti-CD19和BCMA為代的多種CAR-T免疫細(xì)胞療法攻克了一部分血液瘤，多種AAV療法也給一些難以成藥的罕見病提供了有效的zhiliao方案。另一方面，基于CRISPR基因編輯技術(shù)的眾多基因療法也進(jìn)展迅速，較早體外基因編輯療法較快今年年底能夠上市（CRISPR Therapeutics CTX001），體內(nèi)基因編輯療法取得了不錯的臨床數(shù)據(jù)（Intellia Therapeutics NTLA-2001），使用CRISPR技術(shù)制造的通用型CAR-T療法也是免疫細(xì)胞療法發(fā)展的一大趨勢（Caribou Biosciences CB-010）。脫靶檢測企業(yè)，推薦唯可生物，實(shí)驗(yàn)實(shí)力強(qiáng)，專業(yè)性高，檢測效率高，結(jié)果準(zhǔn)確率高。蘇州脫靶檢測安全性評價

CIRCLE-seq原理。細(xì)胞內(nèi)檢測方法由于提純的基因組已經(jīng)消化去除了組蛋白，結(jié)構(gòu)較細(xì)胞內(nèi)的染色質(zhì)更為松散，理論上容易找到更多的脫靶位點(diǎn)。為捕獲CRISPR在細(xì)胞內(nèi)工作時真實(shí)發(fā)生的脫靶切割，研究者們也設(shè)計(jì)了一些細(xì)胞內(nèi)的脫靶位點(diǎn)檢測方法。1) Guide-seqCRISPR造成DNA雙鏈斷裂后，由于DNA修復(fù)機(jī)制的存在，斷裂處很快就會重新連接，這時候提純基因組DNA很難保留CRISPR造成的DNA斷裂位點(diǎn)。所以為了記錄細(xì)胞內(nèi)真實(shí)的CRISPR脫靶切割，研究者們設(shè)計(jì)了Guide-seq[10]，利用NHEJ的DNA修復(fù)機(jī)制，將一段雙鏈短核苷酸序列（dsODN）連接到CRISPR造成的DNA雙鏈斷裂處，相當(dāng)于連接了一輪接頭，然后再正常打斷基因組，在另一側(cè)連接第二輪接頭。通過這種方式構(gòu)建的文庫，就可以獲取脫靶位點(diǎn)一側(cè)的序列。雖然每次CRIPSR導(dǎo)致的DNA雙鏈斷裂并不一定都會連接dsODN，但反過來說，越容易連接dsODN的位點(diǎn)，其發(fā)生脫靶切割的概率越高。通過Guide-seq找到的脫靶位點(diǎn)偏少，但一般都是可信度較高的脫靶位點(diǎn)，Guide-seq也是目前比較公認(rèn)的一種脫靶檢測方法。寧波基因療法脫靶檢測方法檢測脫靶效應(yīng)比較好的方法:CIRCLE-seq。

檢測方法的敏感度、特異性和可重復(fù)性應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證，并設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)年栃院完幮詫φ?；?dāng)體內(nèi)靶細(xì)胞或替代細(xì)胞中載體序列陽性的比例超出預(yù)期范圍時，應(yīng)開展克隆性生長的評估。如果存在優(yōu)勢克隆或單克隆生長，應(yīng)在不超過3個月的時間內(nèi)再次檢測確認(rèn)，并盡快開展整合位點(diǎn)的分析。當(dāng)載體的整合位點(diǎn)確定后，應(yīng)與人類基因組數(shù)據(jù)庫及基因組的其他數(shù)據(jù)庫等進(jìn)行比較，確定整合位點(diǎn)的基因功能，評估是否與包括zheng在內(nèi)的任何疾病有關(guān)。如果受試者體內(nèi)出現(xiàn)載體陽性細(xì)胞的克隆性生長，或檢測發(fā)現(xiàn)基因整合位點(diǎn)在基因或相關(guān)基因附近，應(yīng)縮短檢測間隔至不超過3個月并密切監(jiān)測惡性liu征兆，直至檢測不到基因zhiliao載體。

長期表達(dá)。與其他產(chǎn)品相比，部分基因zhiliao產(chǎn)品的明顯特征是可以在患者靶細(xì)胞或基因修飾細(xì)胞中持續(xù)存在并編碼表達(dá)作用因子（功能性蛋白或基因表達(dá)調(diào)節(jié)元件），并通過長久或長期改變靶細(xì)胞或組織的功能來達(dá)到zhiliao效果。同時，由于基因zhiliao編碼的作用因子在體內(nèi)的長期暴露或表達(dá)異常，可能產(chǎn)生與其功能相關(guān)的長期安全性風(fēng)險，如細(xì)胞生長失控和惡性liu形成、自身免疫反應(yīng)或其他無法預(yù)測的遲發(fā)性不良反應(yīng)。潛伏再jihuo。部分病毒類基因zhiliao產(chǎn)品可能存在從潛伏期被再jihuo的可能性或者引起機(jī)體中已有病毒ganran的再jihuo，存在ganran相關(guān)的遲發(fā)性不良反應(yīng)的風(fēng)險。脫靶(off-target)效應(yīng)是指MicroRNA Agomir/Antagomir可以與特異性互補(bǔ)的核苷酸序列結(jié)合。

基因zhiliao產(chǎn)品特有的可能會引起遲發(fā)性不良反應(yīng)的風(fēng)險因素包括：基因組整合活性基因zhiliao產(chǎn)品可能會采用修飾宿主基因組的技術(shù)，并有可能在宿主細(xì)胞或組織中持續(xù)存在。很多基因zhiliao載體的基因整合不會指向基因組的特定位點(diǎn)，可能在整合位點(diǎn)處產(chǎn)生插入突變、或jihuo整合位點(diǎn)附近的原基因等，進(jìn)而破壞重要基因功能或增加惡性liu的風(fēng)險，例如，國外已有多項(xiàng)研究報告在接受了使用γ-逆轉(zhuǎn)錄病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)的基因修飾細(xì)胞zhiliao的受試者中發(fā)生白血病。因此，對于存在此類風(fēng)險的產(chǎn)品，有必要進(jìn)行長期隨訪臨床研究以評估出現(xiàn)遲發(fā)不良反應(yīng)的風(fēng)險。內(nèi)基因編輯技術(shù)可能造成的脫靶效應(yīng),建立了一種被命名為GOTI。高精度脫靶檢測分析

隨著脫靶影響因素、降低策略及脫靶檢測技術(shù)研究的不斷深入，未來CRISPR/Cas9系統(tǒng)將在更多領(lǐng)域造福人類。蘇州脫靶檢測安全性評價

如何檢測脫靶效應(yīng)？在gRNA修飾中，截短的sgRNA是一種減少脫靶效應(yīng)的簡單方法，并且基于RNP的遞送在大多數(shù)情況下適用于獲得更高的目標(biāo)活性。此外，選擇合適的Cas變體對于減少脫靶效應(yīng)也至關(guān)重要。但選擇合適的脫靶檢測工具，也是重中之重。脫靶預(yù)測結(jié)合PCR檢測法，利用脫靶預(yù)測軟件預(yù)測潛在的脫靶位點(diǎn)，PCR擴(kuò)增預(yù)測的脫靶位點(diǎn)，利用直接測序或酶切法檢測脫靶情況。操作簡便、成本低偏倚性預(yù)測。全基因組測序，一種通過高通量測序檢測脫靶突變的方法，需要選擇適當(dāng)?shù)膮⒖蓟蚪M過濾背景突變，數(shù)據(jù)比對分析獲得含有PAM基序的潛在修飾位點(diǎn)，進(jìn)一步基因擴(kuò)增驗(yàn)證其突變情況。高通量全基因組范圍檢測可檢測SNPs，Indels和染色體水平變化。蘇州脫靶檢測安全性評價