蘇州細(xì)胞療法載體拷貝數(shù)檢測(cè)

拷貝數(shù)，是指某基因（可以是質(zhì)粒）在某一生物的基因組中的個(gè)數(shù)。單拷貝就是該基因在該生物基因組中只有一個(gè)，多拷貝則指有多個(gè)。在細(xì)菌細(xì)胞中，根據(jù)復(fù)制特性，質(zhì)粒分嚴(yán)緊型和松弛型兩類(lèi)，前者在細(xì)胞中只含1?2個(gè)，而后者含10?15個(gè)以上。恒定的拷貝數(shù)與質(zhì)粒復(fù)制控制系統(tǒng)、宿主細(xì)胞遺傳背景及生長(zhǎng)條件有關(guān)?？截悢?shù)變異(Copynumbervariation,CNV)是由基因組發(fā)生重排而導(dǎo)致的,一般指長(zhǎng)度為1kb以上的基因組大片段的拷貝數(shù)增加或者減少,主要表現(xiàn)為亞顯微水平的缺失和重復(fù)。用于檢測(cè)慢病毒載體拷貝數(shù)的方法及其應(yīng)用。蘇州細(xì)胞療法載體拷貝數(shù)檢測(cè)

一般情況下重組載體基因較少整合到基因組中，但近年來(lái)已發(fā)現(xiàn)載體基因整合到特定基因座中導(dǎo)致的可能性。建議設(shè)計(jì)時(shí)充分考慮重組載體的安全性，關(guān)注目的基因的啟動(dòng)子選擇、給藥劑量、整合區(qū)域等多種相關(guān)因素。建議對(duì)病毒載體進(jìn)行全基因組測(cè)序。另外，也可將病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)目標(biāo)細(xì)胞后，對(duì)整合有載體序列的細(xì)胞基因組進(jìn)行測(cè)序，說(shuō)明載體骨架及目的基因序列的準(zhǔn)確性。對(duì)于整合型載體還應(yīng)考慮插入突變的風(fēng)險(xiǎn)，應(yīng)對(duì)插入位點(diǎn)進(jìn)行分析并說(shuō)明對(duì)細(xì)胞存在的潛在的安全性影響，并對(duì)分析方法的合理性進(jìn)行說(shuō)明。嘉興CAR-T載體拷貝數(shù)分析腺相關(guān)病毒的基因組為單鏈 DNA,外源 DNA 拷貝數(shù)病毒基因組拷貝數(shù)。

為促進(jìn)及早發(fā)現(xiàn)此類(lèi)風(fēng)險(xiǎn)并提供有效地風(fēng)險(xiǎn)控制措施，本指導(dǎo)原則在借鑒ICHE2E藥物警戒計(jì)劃、《藥物警戒質(zhì)量管理規(guī)范》和國(guó)內(nèi)外風(fēng)險(xiǎn)管理計(jì)劃相關(guān)指導(dǎo)原則的基礎(chǔ)上，列舉了CAR-T細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品可能存在的安全性風(fēng)險(xiǎn)，以及常規(guī)和本類(lèi)產(chǎn)品特異的額外藥物警戒活動(dòng)和風(fēng)險(xiǎn)較小化措施。CAR-T細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品的風(fēng)險(xiǎn)識(shí)別應(yīng)盡早開(kāi)始，并在整個(gè)研發(fā)過(guò)程中持續(xù)進(jìn)行，以在可能的情況下預(yù)防、較小化風(fēng)險(xiǎn)。隨著對(duì)風(fēng)險(xiǎn)認(rèn)知的變化，應(yīng)及時(shí)更新風(fēng)險(xiǎn)管理計(jì)劃。本指導(dǎo)原則包括CAR-T細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品申報(bào)上市臨床風(fēng)險(xiǎn)管理計(jì)劃的結(jié)構(gòu)和內(nèi)容，重點(diǎn)就撰寫(xiě)CAR-T細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品風(fēng)險(xiǎn)管理計(jì)劃時(shí)的特殊考慮進(jìn)行描述，CAR-T細(xì)胞zhiliao產(chǎn)品申報(bào)上市臨床風(fēng)險(xiǎn)管理計(jì)劃還應(yīng)參考ICHE2E、《藥物警戒質(zhì)量管理規(guī)范》以及我國(guó)藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)發(fā)布的有關(guān)技術(shù)指導(dǎo)原則。隨著技術(shù)的發(fā)展和相關(guān)研究數(shù)據(jù)的積累，本指導(dǎo)原則也將適時(shí)進(jìn)行更新。

載體拷貝數(shù)檢測(cè)唯可生物開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種基于探針的定量聚合酶鏈反應(yīng)(qPCR)分析方法，用于慢病毒載體拷貝數(shù)(VCN)定量。該分析利用基于Taqman水解探針的方法對(duì)100ng級(jí)別的人類(lèi)基因組DNA中的目標(biāo)拷貝進(jìn)行定量?；谔结樀膓PCR，用于靈敏和準(zhǔn)確的VCN定量LV載體拷貝數(shù)qPCR分析可根據(jù)監(jiān)管要求，使用100ng級(jí)別的人類(lèi)基因組DNA，定量從10000000到10個(gè)拷貝的載體拷貝數(shù)。由于在評(píng)估未翻譯的人類(lèi)基因組DNA時(shí)未檢測(cè)到背景噪聲水平，因此該分析具有高度特異性。驗(yàn)證慢病毒載體基因組拷貝的定量qPCR分析可用于定量測(cè)定人類(lèi)基因組DNA中的慢病毒載體基因組拷貝。該分析滿足研究/患者樣本分析的目標(biāo)特異性、精密度和準(zhǔn)確度要求。如何查到某個(gè)載體的拷貝數(shù)?

使用核酸載體進(jìn)行基因轉(zhuǎn)導(dǎo)或修飾時(shí)，應(yīng)持續(xù)關(guān)注細(xì)胞產(chǎn)品中載體系統(tǒng)的殘留情況，分析外源在基因組中的插入位置、拷貝數(shù)等，監(jiān)控基因編輯用酶的細(xì)胞內(nèi)持續(xù)表達(dá)時(shí)間等，并在受試者給藥后進(jìn)行長(zhǎng)期安全性監(jiān)測(cè)。當(dāng)基因zhiliao產(chǎn)品在生殖qiguan持續(xù)存在時(shí)，需要進(jìn)一步研究確定其在生殖細(xì)胞（例如卵母細(xì)胞、精子）的暴露水平。根據(jù)載體類(lèi)型、復(fù)制能力、基因組整合特性、劑量水平、給藥途徑等因素，分析評(píng)估基因zhiliao產(chǎn)品生殖系整合風(fēng)險(xiǎn)?；騴hiliao產(chǎn)品將遺傳物質(zhì)轉(zhuǎn)移到宿主細(xì)胞內(nèi)或整合到宿主基因組中或?qū)λ拗骰蚪M進(jìn)行編輯，存在潛在的遺傳毒性風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)于判斷細(xì)胞基因組插入/修飾是否會(huì)產(chǎn)生遺傳毒性、是否較終會(huì)發(fā)生變依然還缺乏系統(tǒng)的認(rèn)知，因此，需要分析基因組改變（載體或遺傳物質(zhì)整合進(jìn)基因組、對(duì)基因組編輯等）的特征，并評(píng)估相關(guān)潛在風(fēng)險(xiǎn)。一些整合性載體（如逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、轉(zhuǎn)座子）可將外源基因插入整合到細(xì)胞基因組中，這可能會(huì)導(dǎo)致關(guān)鍵基因突變或jihuo原基因，從而導(dǎo)致惡性風(fēng)險(xiǎn)增加。載體拷貝數(shù)的分析方法，歡迎咨詢上海唯可生物科技有限公司。杭州 LV載體拷貝數(shù)安全性評(píng)價(jià)

載體拷貝數(shù)計(jì)算公式:copies/ml(拷貝數(shù))=(6.02 x 10(23)次拷貝數(shù)/摩爾) x (濃度) / (MW g/mol)。蘇州細(xì)胞療法載體拷貝數(shù)檢測(cè)

利用ddPCR檢測(cè)溶液中空載體的濃度和整合到T細(xì)胞群中的CAR和TCR載體的平均數(shù)量。ddPCR檢測(cè)到的平均每個(gè)細(xì)胞的載體拷貝數(shù)與流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到的細(xì)胞轉(zhuǎn)導(dǎo)比例呈線性關(guān)系。使用ddPCR與Real-time PCR的定量精度比較表明，ddPCR明顯更精確，測(cè)量的差異減少了7倍，文中通過(guò)一些數(shù)據(jù)的比較說(shuō)明了ddPCR具有更高的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。使用ddPCR測(cè)定法通過(guò)不同的工作人員獲得了類(lèi)似的載體拷貝數(shù)測(cè)量結(jié)果，突出了該測(cè)定法在技術(shù)人員之間的可重復(fù)性。對(duì)新鮮的和冷凍保存的CAR T和TCR工程改造的T細(xì)胞進(jìn)行的分析得出了相似的結(jié)果。說(shuō)明ddPCR是一種準(zhǔn)確定量CAR和TCR工程T細(xì)胞中平均載體拷貝數(shù)的強(qiáng)大工具。該試驗(yàn)也適用于其他類(lèi)型的基因工程細(xì)胞，包括自然殺傷細(xì)胞和造血干細(xì)胞。蘇州細(xì)胞療法載體拷貝數(shù)檢測(cè)