每孔加入100μl養(yǎng)24h后，Luciferin使其終濃度為150μg/ml，PBS，再加入D-立即用活題成像系統(tǒng)檢測，分析發(fā)光強度與細胞數(shù)之間的相關性。4)細胞生長曲線繪制MCF7-luc細胞和作為對照取表達熒光素酶的MCF-7細胞，接種于24孔板，接種密度為2×104/孔。細胞接種后1～7d，每天胰蛋白酶消化其中3孔細胞，用細胞計數(shù)儀測定細胞數(shù)。以細胞生長天數(shù)為橫坐標，細胞數(shù)目為縱坐標，分別繪制兩種細胞生長曲線。二．動物模型BLAB/c裸鼠皮下移植瘤模型的建立BLAB/cnu/nu裸鼠，4～5周齡，體重（15±2）g，雌雄各3只。取對數(shù)生長期的MCF-7用PBS重懸為2．5×10/ml懸液，每只裸鼠左右背側近腋部皮下接種100μl，共接種6只。接種后第5d采用德國BERTHOLD公司的活題成像系統(tǒng)檢測信號強度。以后每5d觀測一連續(xù)觀測30d。觀測前每只裸鼠戊巴比妥鈉麻醉（計量為：35mg/kg體重），按150mg/kg體重的量腹腔注射luciferin（invivograde），10min后，進行活題成像觀察皮下腫大的瘤的生長情況，定量分析各時間點的熒光值。繪制腫大的瘤皮下生長曲線.MCF-7-luc細胞裸鼠皮下移植瘤的病理形態(tài)學觀察MCF-7-luc細胞裸鼠皮下接種后25d，脫頸處死小鼠，取腫大的瘤組織，制成石蠟切片，切片厚度為3μm。D-熒光素鉀鹽測試怎么樣？揚州熒光素D-熒光素鉀鹽活題成像原理
可用于需要低檢測限的測定具有用于研究基因調控和功能的快速，簡單且均一的生物發(fā)光測定法與標準細胞生長培養(yǎng)基的使用兼容高斯熒光素酶近年來，其他熒光素酶（例如高斯熒光素酶）的使用有所增加，因為這些報告基因較小，并且不需要ATP的存在。高斯熒光素酶是一種20kD的蛋白質，可通過氧氣催化腔腸素氧化，產(chǎn)生光。來自于海洋足類高斯氏菌的生物發(fā)光酶在表達后可有效地從哺乳動物細胞中分泌出來。Amplite?高斯熒光素酶報告基因檢測試劑盒使用專有的發(fā)光配方來定量細胞培養(yǎng)基中的熒光素酶活性。當該試劑與高斯熒光素酶相互作用時，產(chǎn)***光產(chǎn)物，該發(fā)光產(chǎn)物提供強發(fā)光。Amplite高斯熒光素酶報告基因測定試劑盒特點：提供了與HTS液體處理儀器兼容的所有基本組件它們具有高靈敏度，可以以方便的96孔和384孔微量滴定板形式進行半衰期為一小時的“輝光型”信號在大量檢測板之間提供一致的信號與標準細胞生長培養(yǎng)基兼容海腎熒光素酶海腎螢光素酶是一種從海桑（Renillareniformis）分離的36kDa蛋白。與螢火蟲熒光素酶相比，海腎熒光素酶的底物和輔因子要求不同。海腎熒光素酶在氧氣存在下使用腔腸素，產(chǎn)生480nm的藍光。與螢火蟲螢光素酶類似。揚州熒光素D-熒光素鉀鹽活題成像原理光量子數(shù)與熒光素酶的濃度呈正相關性。
可用熒光素酶檢測系統(tǒng)靈敏方便地測定熒光素酶基因的表達。熒光素酶報告基因有許多優(yōu)點：①非放射性；②比CAT及其他報告基因速度快；③比CAT靈敏100倍；④熒光素酶在哺乳細胞中的半衰期為3小時，在植物中的半衰期為3．5小時。由于半衰期短，故啟動子的改變會即時導致熒光素酶活性的改變，而熒光素酶不會積累。相反，CAT在哺乳細胞中的半衰期為50小時。熒光素酶濃度在10—16mol/L（10pS/L）到10-8mol/L（1mg/L）范圍內，熒光信號強度與酶濃度成正比。在理想條件下，可檢測到l0-20mol/L的熒光素酶。檢測步驟：1．用生物信息學方法分析并預測啟動子區(qū)可能的轉錄因子結合位點。2．設計引物用PCR法從基因組DNA中克隆所需的靶啟動子片段，將此片段插入到熒光素酶報告基因質粒（pGL3-basic）中。3．篩選陽性克隆，測序。擴增克隆并提純質粒備用。4．擴增轉錄因子質粒，提純備用。同時準備相應的空載質粒對照，提純備用。5．培養(yǎng)293（或其它目的細胞），并接種于24孔板中，生長10-24小時（80%匯合度）。6．將報告基因質粒與轉錄因子表達質粒共轉染細胞。7．提取蛋白并用于熒光素酶檢測。8．加入底物，測定熒光素酶的活性。9．計算相對熒光強度，并與空載對照比較。
GT-NHSCy3-NHS酯Cy7-NHS酯5-羧基熒光素-NHS酯6-羧基熒光素-NHS酯5(6)-羧基熒光素-NHS酯6-羧基熒光素D熒光素鈉鹽D-Luciferin,SodiumSaltD-熒光素鉀鹽D-Luciferin,PotassiumSaltD-熒光素螢火蟲，游離酸D-LuciferinFirefly,freeacid螢火蟲熒光素酶fireflyluciferase海腎熒光素酶Renillaluciferase天然腔腸熒光素Coelenterazineh腔腸素hCoelenterazinef腔腸素fCoelenterazineh/腔腸素h腔腸熒光素活題成像用D-luciferin,potassiumsalt熒光素鉀鹽介紹一、活題成像技術簡介活題生物發(fā)光成像技術能夠讓研究人員直接快速的測量各種哎癥模型中腫大的瘤的生長、轉移以及對藥物的反應。在藥效學評價方面，熒光素酶哎癥模型可用于哎癥體內用藥在整體動物水平上進行長期療效跟蹤觀察。利用無創(chuàng)傷活題成像對哎細胞生長的檢測，可對哎癥治的好之前和過程中的哎細胞的變化進行實時觀測和評估。熒光素酶的發(fā)光是生物發(fā)光，不需要激發(fā)光，但需要底物熒光素(D-Luciferin)。熒光素酶的底物熒光素，約280道爾頓。熒光素的水溶性和脂溶性都非常好，很容易穿透細胞膜和血腦屏障。熒光素是腹腔注射或尾部靜脈注射進入小鼠體內的，約一分鐘就可以擴散到小鼠全身。熒光素。南京靠譜的D-熒光素鉀鹽測試公司。
可運用熒光素酶報告系統(tǒng)分析其相對活性。c.驗證特定轉錄因子同其調控序列的作用，將該序列（通常為啟動子區(qū)域）插入報告基因載體，同時在實驗細胞***轉過表達該轉錄因子，可分析轉錄因子過表達是否提高熒光素酶活性。d.可以分析信號通路是否***，將該信號通路的下游響應原件序列構建入報告基因載體，在不同上游信號條件下，熒光素酶活性**了通路的下游響應。例如在GPCR研究中，將cAMPresponseelement（CRE）載入報告基因載體，構建穩(wěn)定表達細胞株后，可以用于分析GPRC的***與6b7a976f-99ae-4c48-8159-4bd篩選。又如，將HIF1α的響應原件hypoxia-responsiveelement(HRE)插入luciferase報告載體構建穩(wěn)轉細胞株，可以用于低氧相關通路的研究。e.驗證microRNA的靶序列，將待測的3’UTR序列插入報告基因載體，再共轉入該microRNA，如果熒光素酶活性下降，則提示為其靶序列。Q：在[信諾金達]做熒光素酶報告基因檢測，需要提供什么？實驗結果包括哪些？您需要提供：1.基因序列或模板，需提供詳細的轉錄因子、目的基因或microRNA信息；2.實驗細胞，[信諾金達]默認為使用293T細胞，實驗結束后，[信諾金達]會為您提供實驗流程及完整報告一份，包括實驗原始數(shù)據(jù)、圖片、分析結果等。D-熒光素鉀鹽的激發(fā)波長是多長？南通體外研究D-熒光素鉀鹽公司
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具體實驗流程：注：該操作流程通常用來檢測轉染了螢火蟲熒光素酶基因的真核細胞中熒光素酶表達的活性，不適用于對細菌熒光素酶進行檢測。1．實驗***天，消化并接種細胞（根據(jù)具體實驗選擇合適的細胞）于35mm細胞培養(yǎng)皿，置于5％CO2、飽和濕度的37℃培養(yǎng)箱內培養(yǎng)過夜。2．等細胞密度達到70％時用Luciferase報告基因質粒、LacZ的表達質粒及其它質粒（根據(jù)具體實驗確定）共轉染細胞（根據(jù)具體實驗選擇轉染方法，如磷酸鈣沉淀法、PEI、lipofectamine2000等均可）。3．轉染24－36h后，吸取培養(yǎng)液，用預冷的PBS（無鈣和鎂離子）洗滌細胞。注：熒光酶的酶促反應會被痕量的鈣所抑制，故用磷酸鈣轉染的細胞在收集細胞前應充分洗滌除去含鈣介質。4．在每個培養(yǎng)皿中加入350μl預冷的harvestbuffer,于4℃或冰上放置10min裂解細胞。5．在細胞裂解期間，準備足量的ml微量離心管，將ATPbuffer與luciferinbuffer以1：，每管100μl。6．依次取等體積的細胞裂解液（100μl）至步驟5中的離心管中，迅速混勻，在發(fā)光儀（Luminometer）上讀取吸光值。注：發(fā)光反應會迅速衰減，將細胞裂解液加入反應液后5s內必須讀取吸光值。7．確保以相同操作手法讀取全部樣品吸光值后。揚州熒光素D-熒光素鉀鹽活題成像原理