本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域：，尤其涉及一種細(xì)胞凍存液，具體涉及一種用于干細(xì)胞的凍存液。背景技術(shù)：：臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，通常是廢棄不用的。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血中含有可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干細(xì)胞，可用于造血干細(xì)胞移植，***80多種疾病。因此，臍帶血已成為造血干細(xì)胞的重要來源，特別是無血緣關(guān)系造血干細(xì)胞的來源。也是一種非常重要的人類生物資源。干細(xì)胞***是將具有不斷自我繁殖能力和多向化潛能的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，再將其移植入患者受損或缺損組織中，從而實(shí)現(xiàn)對損傷組織的補(bǔ)充和修復(fù)。目前干細(xì)胞采集后，需要加入保存液進(jìn)行冷凍保存，細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存過程中的**試劑，關(guān)系到細(xì)胞復(fù)蘇后的活性及數(shù)量等問題，現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液，一方面營養(yǎng)成分單一，配比不當(dāng)，導(dǎo)致細(xì)胞存活率低、穩(wěn)定性差；另一方面大多都是異種血清，會(huì)引入外源蛋白從而增加細(xì)胞污染和過敏的風(fēng)險(xiǎn)，不適用于臨床。因此，為有效開展干細(xì)胞移植及建立干細(xì)胞庫，亟需開發(fā)一種成本低、細(xì)胞存活率高、成分簡單的細(xì)胞凍存液，對于生物醫(yī)學(xué)具有重要的研究與應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。無血清細(xì)胞凍存液一般都是使用什么技術(shù)。泰州細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞凍存液試劑
適用于凍存各種細(xì)胞系、原代細(xì)胞3.無需程序降溫，可直接放置-80℃凍存，操作簡單4.不含血清，**減少細(xì)胞污染5.因不含血清，批次間差異小6.無需液氮，-80℃冰箱長期凍存7.可培養(yǎng)板整板凍存，例如雜交瘤細(xì)胞凍存時(shí)可節(jié)省篩選過程溫馨提示：1.化學(xué)組成明確，以DMEM為母液，含有DMSO，不含牛血清或其他蛋白成分。2.獨(dú)特的細(xì)胞保護(hù)配方，在凍存過程中細(xì)胞可直接放入-70℃冰箱，無需繁瑣的程序降溫操作。3.不含牛血清或其他蛋白成分，不引入造成細(xì)胞種子污染的外源因子，如各種牛源病毒和支原體等。4.不含牛血清或其他蛋白成分，同樣適用于無血清培養(yǎng)的細(xì)胞凍存。5.不含牛血清或其他蛋白成分，非常適合用于凍存那些在使用常規(guī)含牛血清凍存液過程中容易聚團(tuán)的細(xì)胞，如各種293細(xì)胞等。6.包裝設(shè)計(jì)為10ml×5，無需再次分裝，而且在使用過程中不易造成不同使用者或不同細(xì)胞間的交叉污染。7.經(jīng)過Hela、RD、HEK-293、293T、SP2/0、K562和P815等多種細(xì)胞的測試，復(fù)蘇后細(xì)胞存活率均高于用常規(guī)含牛血清凍存液。8.建議凍存24hr后，復(fù)蘇一支，確認(rèn)細(xì)胞正常，再銷毀正在培養(yǎng)的剩余細(xì)胞，避免意外。南京懸浮細(xì)胞凍存液應(yīng)用無血清細(xì)胞凍存液適用范圍包括哪些？
常須將培養(yǎng)物進(jìn)行冷凍保存，并在需要的時(shí)候重新復(fù)蘇和培養(yǎng)。目前，細(xì)胞凍存**常用的技術(shù)是液氮冷凍保存法，主要采用加適量保護(hù)局的緩慢冷凍法保存細(xì)胞。無血清非程序細(xì)胞凍存液，添加了細(xì)胞沉降穩(wěn)定劑可防止或延緩細(xì)胞在凍存過程中的沉降，防止細(xì)胞互相擠壓，影響細(xì)胞凍存效果。另外添加了細(xì)胞膜保護(hù)劑。滲透性細(xì)胞膜內(nèi)保護(hù)劑、非滲透性細(xì)胞保護(hù)劑等多種冷凍保護(hù)劑，它們在溶液中同水分子結(jié)合，發(fā)生水合作用，弱化水的結(jié)晶過程使溶液的粘性增加從而減少冰晶的形成，能**降低細(xì)胞在凍存過程中冰晶對于細(xì)胞的損傷，有效提高細(xì)胞復(fù)蘇率和活力。同時(shí)無任何外源血清成分，減少細(xì)胞污染機(jī)會(huì)，并且無需繁瑣的程序凍存步驟，節(jié)省了大量時(shí)間和精力。內(nèi)***：＜支原體：陰性微生物檢查：陰性滲透壓：280-340m0smol/kgPH：純度：>98%保存溫度：4℃避光保存有效期：24個(gè)月應(yīng)用：?干細(xì)胞儲(chǔ)存?T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的儲(chǔ)存?其他額種類型哺乳動(dòng)物細(xì)胞的儲(chǔ)存產(chǎn)品特性：?無需程序降溫，直接置于-80℃冰箱，后置于液氮保存?1類醫(yī)療器械生產(chǎn)許可?無血清培養(yǎng)基生產(chǎn)可用于臨床。
去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗。3.去除PBS，加入適量胰蛋白酶(覆蓋培養(yǎng)皿表面)把單層生長的細(xì)胞消化下來;4.離心1000rpm，5min;5.去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的**終密度為5×106/ml～1×107/ml;6.將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～7.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者;8.凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min;到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。space(二)細(xì)胞復(fù)蘇1.從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。2.從37℃水浴中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻;3.離心，1000rpm，5min;4.棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度。10%-15%（常見為10%）的DMSO或甘油，含10%-20%血清的凍存培養(yǎng)液。一般來講血清含量可以在10%-90%之間調(diào)整，凍存液中加入血清一方面可以為細(xì)胞提供營養(yǎng)，另一方面可以在細(xì)胞凍存過程中提供非滲透性保護(hù)物質(zhì)，如蔗糖。無血清細(xì)胞凍存液是即用型細(xì)胞凍存液。
對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或等同替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。實(shí)施例1細(xì)胞凍存液的制備以1l體積為標(biāo)準(zhǔn)，按照下列組分的含量，稱取對應(yīng)的重量：上述兩組分充分混勻形成細(xì)胞凍存液。實(shí)施例2臍帶血細(xì)胞的凍存采用實(shí)施例1所述細(xì)胞凍存液，在凍存前24小時(shí)，將該凍存液置于2-8℃進(jìn)行溫度平衡，以臍帶血細(xì)胞為例制備細(xì)胞懸液，取800ul細(xì)胞懸液，按按細(xì)胞懸液(v):細(xì)胞凍存液(v)＝4:1計(jì)算加入細(xì)胞凍存液的體積200ul，并以穩(wěn)定速率加入細(xì)懸液中，這一過程需要在15min之內(nèi)完成，同時(shí)需要不斷進(jìn)行混合，使得細(xì)胞凍存液能夠在細(xì)胞懸液中均勻分布。隨后，將充分混勻的細(xì)胞溶液分裝至，進(jìn)行程序性降溫至-80℃后轉(zhuǎn)至液氮中儲(chǔ)存。從液氮系統(tǒng)中取出凍存的臍帶血細(xì)胞樣品，等待1～2min使殘余液氮揮發(fā)之后，迅速放入37℃水浴中，待可見冰塊剛好要消失至黃豆大小體積時(shí)，取出細(xì)胞樣品計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率結(jié)果如表1所示。實(shí)施例3間充質(zhì)干細(xì)胞的凍存采用實(shí)施例1所述細(xì)胞凍存液，在凍存前24小時(shí)，將該凍存液置于2-8℃進(jìn)行溫度平衡，以間充質(zhì)干細(xì)胞為例制備細(xì)胞懸液，取800ul細(xì)胞懸液，按按細(xì)胞懸液(v):細(xì)胞凍存液(v)＝4:1計(jì)算加入細(xì)胞凍存液的體積200ul，并以穩(wěn)定速率加入細(xì)懸液中。無血清細(xì)胞凍存液存放條件。連云港無血清細(xì)胞凍存液公司
無血清細(xì)胞凍存可直接放入-80℃冰箱。泰州細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞凍存液試劑
無血清細(xì)胞凍存液，含多種保護(hù)劑成分。一些保護(hù)劑，易于穿透細(xì)胞，避免細(xì)胞內(nèi)部水分子形成冰晶損傷細(xì)胞，同時(shí)另一些保護(hù)劑不能穿透細(xì)胞，但可以在冰晶形成之前，優(yōu)先結(jié)合細(xì)胞外的水分子，降低細(xì)胞外溶液的電解質(zhì)濃度，減少陽離子進(jìn)入細(xì)胞的數(shù)量，為多種保護(hù)劑組合，在細(xì)胞內(nèi)外進(jìn)行雙重保護(hù)，**提高了細(xì)胞復(fù)蘇存活率。無血清細(xì)胞凍存液不含牛血清，無動(dòng)物源組份。2-8℃即可穩(wěn)定保存，無需冷凍，即取即用。凍存細(xì)胞，無需程序降溫。凍存細(xì)胞復(fù)蘇率在90%以上。1.無血清細(xì)胞凍存液用于造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞等干細(xì)胞的儲(chǔ)存。2.無血清細(xì)胞凍存液用于T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞等免疫細(xì)胞的存儲(chǔ)。3.無血清細(xì)胞凍存液用于其他類型哺乳動(dòng)物細(xì)胞的儲(chǔ)存。1.不含牛血清，無動(dòng)物源組分。傳統(tǒng)的凍存液，一般由胎牛血清、DMSO等組分組成。胎牛血清取自牛，因此，難以應(yīng)用到需要避免接觸動(dòng)物源的應(yīng)用領(lǐng)域。用包括人白蛋白等蛋白組分替代血清的用途，無動(dòng)物源組分?！婕纯煞€(wěn)定保存，無需冷凍，即取即用。為了避免反復(fù)凍融，傳統(tǒng)的細(xì)胞凍存液，需要分裝成小管后置于-20℃環(huán)境下保存。無血清細(xì)胞凍存液，2-8℃保存即可，無需再進(jìn)行分裝。在體外培養(yǎng)工作中，為了保留種子和長期保存培養(yǎng)物的活性。泰州細(xì)胞復(fù)蘇細(xì)胞凍存液試劑