本發(fā)明涉及生物醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域：，尤其涉及一種細(xì)胞凍存液，具體涉及一種用于干細(xì)胞的凍存液。背景技術(shù)：：臍帶血是胎兒娩出、臍帶結(jié)扎并離斷后殘留在胎盤和臍帶中的血液，通常是廢棄不用的。近十幾年的研究發(fā)現(xiàn)，臍帶血中含有可以重建人體造血和免疫系統(tǒng)的造血干細(xì)胞，可用于造血干細(xì)胞移植，***80多種疾病。因此，臍帶血已成為造血干細(xì)胞的重要來(lái)源，特別是無(wú)血緣關(guān)系造血干細(xì)胞的來(lái)源。也是一種非常重要的人類生物資源。干細(xì)胞***是將具有不斷自我繁殖能力和多向化潛能的干細(xì)胞在體外培養(yǎng)后，再將其移植入患者受損或缺損組織中，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)損傷組織的補(bǔ)充和修復(fù)。目前干細(xì)胞采集后，需要加入保存液進(jìn)行冷凍保存，細(xì)胞凍存液是細(xì)胞凍存過(guò)程中的**試劑，關(guān)系到細(xì)胞復(fù)蘇后的活性及數(shù)量等問(wèn)題，現(xiàn)有的細(xì)胞凍存液，一方面營(yíng)養(yǎng)成分單一，配比不當(dāng)，導(dǎo)致細(xì)胞存活率低、穩(wěn)定性差；另一方面大多都是異種血清，會(huì)引入外源蛋白從而增加細(xì)胞污染和過(guò)敏的風(fēng)險(xiǎn)，不適用于臨床。因此，為有效開(kāi)展干細(xì)胞移植及建立干細(xì)胞庫(kù)，亟需開(kāi)發(fā)一種成本低、細(xì)胞存活率高、成分簡(jiǎn)單的細(xì)胞凍存液，對(duì)于生物醫(yī)學(xué)具有重要的研究與應(yīng)用價(jià)值。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷。南京做無(wú)血清細(xì)胞凍存液公司有哪幾家。連云港EKBIO Tech細(xì)胞凍存液濃度
用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻；離心，1000rpm，5min；棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度，接種培養(yǎng)瓶，37℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)；次日更換一次培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。注意事項(xiàng)：取錯(cuò)細(xì)胞：拿錯(cuò)凍存管。（快快快，匆忙之中，難免出錯(cuò)，況且－170多度，凍手?。┙鉀Q：（1）核查記錄冊(cè)及凍存管上細(xì)胞的名稱、時(shí)間是否一致。（2）拿細(xì)胞時(shí)戴手套！2.水浴時(shí)間太長(zhǎng)：2min還沒(méi)融化。（凍存管的壁較厚，隔熱）解決：（1）適當(dāng)提高水浴溫度（37度－40度）。（2）要是冬天，就選用保溫盒。3.冰盒內(nèi)時(shí)間太長(zhǎng)：復(fù)蘇1h后，還沒(méi)有加入新的培養(yǎng)液。（高濃度DMSO防止胞內(nèi)形成冰晶，凍存時(shí)保護(hù)細(xì)胞，但復(fù)蘇融解后，浸泡時(shí)間太久會(huì)，對(duì)細(xì)胞有毒性）解決：提前預(yù)定超凈臺(tái)，減少?gòu)?fù)蘇后插在冰盒里等待的時(shí)間。4.失去耐心：復(fù)蘇三四天后，細(xì)胞沒(méi)有任何動(dòng)靜，認(rèn)為失敗，倒掉所有細(xì)胞。（有些細(xì)胞復(fù)蘇后一星期，才有起色）解決：不要換液，耐心等待，兩周后再做決定。一、細(xì)胞凍存液1.無(wú)血清細(xì)胞凍存液產(chǎn)品概述:一種即用型、無(wú)需程序降溫的細(xì)胞凍存液,適用于哺乳動(dòng)物低溫保存。無(wú)需配制，使用簡(jiǎn)單，細(xì)胞復(fù)活率高。產(chǎn)品特點(diǎn)：(1)安全：無(wú)血清。鎮(zhèn)江EKBIO Tech細(xì)胞凍存液說(shuō)明書無(wú)血清細(xì)胞凍存液檢測(cè)的安全性如何保障？
細(xì)胞凍存篇凍存原則細(xì)胞凍存原則為“慢凍”，即讓細(xì)胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍。如果直接將細(xì)胞懸液放在**溫下快速冷凍，細(xì)胞會(huì)受到冷凍損傷而死亡。在凍存液中添加的保護(hù)劑（如DMSO、甘油）和在凍存盒中添加的異丙醇，都起到程序性降溫的作用。DMSO使用注意事項(xiàng)DMSO能夠快速穿透細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞中，延緩溫度下降速度，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護(hù)細(xì)胞的作用。需注意的是，DMSO溶于培養(yǎng)基時(shí)，將釋放大量熱量，所以細(xì)胞凍存液需提前配制，不能直接將DMSO加入含有細(xì)胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細(xì)胞。另外，DMSO屬于致*物質(zhì)，使用時(shí)應(yīng)戴好手套，規(guī)范操作。程序凍存液配方程序凍存液成分一般由基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、DMSO組成。血清比例為10%~90%，DMSO比例為5%~10%。根據(jù)普諾賽實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞培養(yǎng)經(jīng)驗(yàn)，推薦凍存液配比：55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基＋40%胎牛血清＋5%DMSO，難養(yǎng)細(xì)胞可用90%胎牛血清＋10%DMSO凍存。細(xì)胞凍存密度細(xì)胞凍存和復(fù)蘇過(guò)程中，不可避免會(huì)損失部分細(xì)胞，所以凍存的密度不能太低。提高凍存密度有助于提升細(xì)胞復(fù)蘇存活率，推薦密度為100~300萬(wàn)細(xì)胞/mL。凍存操作方法方法一：使用程序凍存盒使用程序降溫盒是**常用的凍存方法。市面上的降溫盒有些需要添加異丙醇。
白蛋白等從而更好地保護(hù)細(xì)胞。有人親測(cè)10%血清凍存細(xì)胞，結(jié)果證明是可以的，但高血清比例的凍存液更有助于提高細(xì)胞活力，此外嬌貴的細(xì)胞可以適當(dāng)提高凍存液中血清的比例以保證獲得更高的存活率及活力。細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍速融，這樣更加有利于保持細(xì)胞的活力。凍存細(xì)胞不加任何保護(hù)劑，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，從而使細(xì)胞產(chǎn)生內(nèi)源性的機(jī)械損傷，引起細(xì)胞內(nèi)環(huán)境滲透壓，PH，電解質(zhì)等的改變，進(jìn)而促使細(xì)胞死亡。常用的凍存保護(hù)劑為二甲基亞砜（DMSO）和甘油，凍存細(xì)胞時(shí)加入保護(hù)劑，一方面可以提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，另一方面使冰點(diǎn)降低，延緩凍結(jié)過(guò)程。緩慢凍存細(xì)胞的過(guò)程中，加入保護(hù)劑可以使細(xì)胞內(nèi)水分滲出到細(xì)胞外，一定程度上減少胞內(nèi)冰晶的產(chǎn)生，而在快速?gòu)?fù)蘇細(xì)胞的過(guò)程中，能使胞外冰晶迅速融化，防止水分滲入胞內(nèi)再次形成冰晶而損傷細(xì)胞。無(wú)血清細(xì)胞凍存液說(shuō)明書。
如果想要達(dá)到這樣的目的，那么就需要細(xì)胞冷卻液，這種東西怎樣配置呢?下面就來(lái)具體的了解一下，細(xì)胞凍存液的配方是什么？(一)細(xì)胞凍存1.配制含10%DMSO或甘油、10～20%小牛血清的凍存培養(yǎng)液;2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，去除舊培養(yǎng)液，用PBS清洗。3.去除PBS，加入適量胰蛋白酶(覆蓋培養(yǎng)皿表面)把單層生長(zhǎng)的細(xì)胞消化下來(lái);4.離心1000rpm，5min;5.去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞均勻，計(jì)數(shù)，調(diào)節(jié)凍存液中細(xì)胞的**終密度為5×106/ml～1×107/ml;6.將細(xì)胞分裝入凍存管中，每管1～7.在凍存管上標(biāo)明細(xì)胞的名稱，凍存時(shí)間及操作者;8.凍存：標(biāo)準(zhǔn)的凍存程序?yàn)榻禍厮俾?1～-2℃/min;當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí)，可增至-5℃～-10℃/min;到-100℃時(shí)，則可迅速浸入液氮中。也可將裝有細(xì)胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過(guò)夜，取出凍存管，移入液氮容器內(nèi)。space(二)細(xì)胞復(fù)蘇1.從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37℃溫水中，并不時(shí)搖動(dòng)令其盡快融化。2.從37℃水浴中取出凍存管，打開(kāi)蓋子，用吸管吸出細(xì)胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻;3.離心，1000rpm，5min;4.棄去上清液，加入含10%小牛血清培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度。無(wú)血清細(xì)胞凍存液的使用說(shuō)明。蘇州EKBIO Tech細(xì)胞凍存液配制比例
無(wú)血清細(xì)胞凍存可直接放入-80℃冰箱。連云港EKBIO Tech細(xì)胞凍存液濃度
再放入-80℃冰箱冷凍過(guò)夜，次日保存到液氮罐中。目前更多使用程序降溫盒，將細(xì)胞凍存管放于盒內(nèi)，直接置于超低溫冰箱，程序降溫盒可控制每分鐘下降1℃。目前也有商業(yè)化的快速凍存液，可不經(jīng)過(guò)程序降溫過(guò)程，直接置于超低溫冰箱。注：細(xì)胞凍存后可以長(zhǎng)期保存，但為妥善起見(jiàn)，凍存半年后，**好取出一支凍存管的細(xì)胞復(fù)蘇培養(yǎng)，觀察生長(zhǎng)情況，然后再繼續(xù)凍存。懸浮細(xì)胞的凍存1.直接將細(xì)胞收集到離心管，棄上清3.以生長(zhǎng)培養(yǎng)基（含20%胎牛血清）或100%胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約107/ml，加入10%的DMSO。4.以每管1ml分裝至凍存管中。5.置于4oC30min，再轉(zhuǎn)入-20℃2h后，再放入-80℃冰箱冷凍過(guò)夜，次日保存到液氮罐中；或置于程序降溫盒中，按相關(guān)的操作指南進(jìn)行操作。液氮罐使用注意事項(xiàng)1．初次使用前檢查容器內(nèi)膽是否清潔干燥，外部有無(wú)凹陷及嚴(yán)重碰傷，如有輕微凹陷及碰傷，經(jīng)試驗(yàn)其蒸發(fā)性能不變，仍可繼續(xù)使用，如性能下降，應(yīng)停止使用，避免經(jīng)濟(jì)損失。2．液氮容器應(yīng)放在陰涼干燥處，應(yīng)有良好的通風(fēng)，不應(yīng)放置在靠近熱源，陽(yáng)光直照，以及風(fēng)口處，嚴(yán)禁放置液氮容器的房間緊閉門窗，以免室內(nèi)因液氮蒸發(fā)使氧氣含量下降，造成呼吸困難。3．只能用于充裝液氮，凍存細(xì)胞和病毒用。連云港EKBIO Tech細(xì)胞凍存液濃度
南京翌科生物科技有限公司位于仙林街道緯地路9號(hào)江蘇生命科技園F7棟301-3室。公司業(yè)務(wù)涵蓋外泌體提取，非編碼RNA試劑，檢測(cè)試劑，轉(zhuǎn)染試劑等，價(jià)格合理，品質(zhì)有保證。公司注重以質(zhì)量為中心，以服務(wù)為理念，秉持誠(chéng)信為本的理念，打造商務(wù)服務(wù)良好品牌。翌科生物立足于全國(guó)市場(chǎng)，依托強(qiáng)大的研發(fā)實(shí)力，融合前沿的技術(shù)理念，飛快響應(yīng)客戶的變化需求。