國內(nèi)病毒二代測序進(jìn)化分析檢測

二代測序應(yīng)用的患者類型的推薦：共識(shí)明確指出了二代測序應(yīng)用的患者類型及使用的時(shí)機(jī)的意見:對于神經(jīng)系統(tǒng)急性傳染/血流傳染/呼吸道傳染患者，3天是二代測序使用的時(shí)機(jī)，在傳統(tǒng)方法(常規(guī)的生化檢查和培養(yǎng))3天未報(bào)陽性且經(jīng)驗(yàn)性調(diào)整無效時(shí)，強(qiáng)烈推薦二代測序檢測；對疑似病毒傳染患者，包括：疑似神經(jīng)系統(tǒng)病毒傳染和病毒性肺炎且病情持續(xù)進(jìn)展的患者，若完善傳統(tǒng)PCR檢測后依然未獲得明確的病原學(xué)證據(jù)時(shí)，強(qiáng)烈推薦二代測序檢測。對于疑似局灶性傳染患者完成常規(guī)的生物化學(xué)、培養(yǎng)或PCR檢測后，若未能獲取病原學(xué)診斷結(jié)果，推薦將二代測序作為檢測方法。而對于懷疑繼發(fā)性血流傳染患者：在原發(fā)傳染灶的病原學(xué)檢測為陰性或因各種因素?zé)o法送檢合適標(biāo)本的情況下，可考慮將血標(biāo)本的二代測序檢測作為二線檢測。想要通過高通量測序獲得病毒全序列，需要經(jīng)歷:核酸純化-文庫構(gòu)建-生物信息學(xué)分析這三大基本流程.國內(nèi)病毒二代測序進(jìn)化分析檢測

全基因組測序要注意的事項(xiàng)：全基因組測序是對未知基因組序列的物種進(jìn)行個(gè)體的基因組測序。技術(shù)路線：提取基因組DNA，然后隨機(jī)打斷，電泳回收所需長度的DNA的片段（0.2~5Kb），加上接頭,進(jìn)行DNA簇（Cluster）制備，后利用Paired-End（Solexa）或者M(jìn)ate-Pair（SOLiD）的方法對插入片段進(jìn)行測序。然后對測得的序列組裝成Contig，通過Paired-End的距離可進(jìn)一步組裝成Scaffold，進(jìn)而可組裝成染色體等。組裝效果與測序深度與覆蓋度、測序質(zhì)量等有關(guān)。常用的組裝有：SOAPdenovo、Trimity、Abyss等。測序深度（Sequencingdepth）是指測序得到的堿基總量（bp）與基因組大小的比值，它是評價(jià)測序量的指標(biāo)之一。測序深度與基因組覆蓋度之間是一個(gè)正相關(guān)的關(guān)系，測序帶來的錯(cuò)誤率或假陽性結(jié)果會(huì)隨著測序深度的提升而下降。測序的個(gè)體，如果采用的是雙末端或Mate-Pair方案，當(dāng)測序深度在50X~100X以上時(shí)，基因組覆蓋度和測序錯(cuò)誤率控制均得以保證，后續(xù)序列組裝成染色體才能變得更容易與準(zhǔn)確。

RNA病毒全序列測序突變分析高通量測序技術(shù)正式啟用之后,研究者可以將樣品處理至標(biāo)準(zhǔn)濃度和體積后進(jìn)行測序和分析.

病毒準(zhǔn)種的漂變將使毒株的特點(diǎn)及傳播方式發(fā)生改變，給現(xiàn)有的檢測手段和防治措施帶來嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。新一代高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)使得檢測某個(gè)物種的混合PCR產(chǎn)物中低頻率的變異體十分便利它的出現(xiàn)加快了研究準(zhǔn)種的規(guī)律性和影響因素的步伐。新一代測序儀將以往的測序費(fèi)用降低了好幾個(gè)數(shù)量級。鑒于此，以前只有大型測序中心才能夠開展的項(xiàng)目，現(xiàn)在在小型實(shí)驗(yàn)室里也能順利進(jìn)行了，按照目前的發(fā)展速度，新一代高通量測序技術(shù)有望給生物學(xué)和生物醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域帶來**性的變革。

一直以來，病毒基因組測序都是疾病診斷、流行病學(xué)調(diào)查和宿主-病原關(guān)系研究的重要手段。病毒的全基因組測序以及對應(yīng)的生物信息學(xué)分析方法是研究病毒進(jìn)化、毒力因子變異、疫病爆發(fā)之間的關(guān)系、疫病傳播途徑、不同遺傳變異的分布模式、疫病發(fā)生地理區(qū)域的基礎(chǔ)。與傳統(tǒng)Sanger測序相比，NGS技術(shù)的發(fā)展使得一個(gè)小的研究小組可以擁有大量病毒株的全基因組序列，測序成本也在逐步降低。由于NGS產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量非常龐大，其序列拼接難度也隨之增加。而且對于低濃度高復(fù)雜度的樣本，研究者除了PCR外別無他法。而PCR方法往往具有偏好性，丟失的片段將為序列組裝帶來非常高的失敗率。對于完全未知的樣本，無法通過PCR進(jìn)行富集，要鑒定其種類需要調(diào)用各種方法，逐個(gè)嘗試，工作量之大，其效率之低，使得一個(gè)新的研究方法的出現(xiàn)及其必要。

病毒全基因組測序具有的特點(diǎn):獨(dú)有的一定定量技術(shù)，實(shí)現(xiàn)病原定量分析。

病毒的基因重組特點(diǎn)是什么？ 滅活病毒間也會(huì)發(fā)生重組 ：例如用紫外線滅活的兩株同種病毒，一同培養(yǎng)常可使滅活的病毒復(fù)活產(chǎn)生出侵染性病毒體，此稱為多重復(fù)活（Multiplicity reactivation），這是因?yàn)閮煞N病毒核酸上受損害的基因部位不同，由于重組相互彌補(bǔ)而得到復(fù)活。因此現(xiàn)今不用紫外線滅活病毒制造疫苗，以防復(fù)活。 死活病毒間發(fā)生重組 ：例如將能在雞胚中生長良好的甲型流感病毒（A0或A1亞型）疫苗株經(jīng)紫外線滅活后，再加亞洲甲型（A2亞型）活流感病毒一同培養(yǎng)，產(chǎn)生出具有前者特點(diǎn)的A2亞型流感病毒，可供制作疫苗，此稱為交叉復(fù)活。病毒全基因組測序具有的特點(diǎn)：獨(dú)有的一定定量技術(shù),實(shí)現(xiàn)病原定量分析。國內(nèi)病毒二代測序進(jìn)化分析檢測

高通量測序技術(shù)本身并不是以病毒為目標(biāo)開發(fā)的。國內(nèi)病毒二代測序進(jìn)化分析檢測

對病毒的全基因組進(jìn)行測序：對病毒的全基因組進(jìn)行測序主要是通過非特異性擴(kuò)增+克隆結(jié)合sanger測序來完成的。當(dāng)物種有了參考的序列之后，可以通過特異性擴(kuò)增+sanger測序獲得全基因組序列。Sanger測序準(zhǔn)確度高，讀長很長，但與此同時(shí)，擴(kuò)增和克隆工作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，由于流程繁瑣，加上快速變異導(dǎo)致引物無法通用，該方法對于大量基因組的測序工作而言，可操作性不強(qiáng)，這對于研究者一直是一個(gè)困擾。高通量測序技術(shù)正式啟用之后，研究者可以將樣品處理至標(biāo)準(zhǔn)濃度和體積后進(jìn)行測序和分析，減少了工作量，增加了成功率。探普生物進(jìn)行了大量有針對性的研發(fā)和測試，開發(fā)了全套的實(shí)驗(yàn)和分析流程用于對病毒的全基因組進(jìn)行測序，該流程自運(yùn)行以來廣受研究者們好評。

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