相對定量實驗方法包括兩種重要方法：ΔΔCT Method：使用內參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內參基因與目的基因可以同時反應，也可以單獨反應；雙標準曲線法：對每個樣品的內參基因和目的基因都做定量，求出每個樣品中內參基因和目的基因的數(shù)量，然后根據(jù)相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。定量需要由標準曲線建立Ct值跟拷貝數(shù)之間的關系，標準曲線由標準品生成，標準品可以是已知濃度的RNA、質?；蚝铣傻墓押塑账徭溕?，定量未知模板時標準樣品和未知樣品必須同時反應。實時熒光定量PCR指在PCR反應體系加入熒光基團，熒光信號實時監(jiān)測PCR,通過標準曲線對未知模板進行定量分析.珠?？焖賟PCR儀設置
PCR：Polymerase chain reaction. 是體外模擬生物的DNA 復制。需要DNA 聚合酶，DNA 模板，兩端引物，脫氧核苷酸dNTPs( dATP, ACTP, dGTP, dTTP),以及適當?shù)木彌_體系。PCR 產物的增長形式為２N (如果各種試劑和外部所加條件均理想化，N 是循環(huán)數(shù))。實際中，擴增效率不為100％。Real time PCR 是定量PCR 的一種，當然是在PCR 的基礎上發(fā)展出來的。（普通）PCR 包含很多因素，屬性，如：試劑，溫度，循環(huán)數(shù)，程序，PCR 產物（擴增子，amplicon）的量，擴增曲線（擴增子累積曲線），摻錯率，擴增子長度。一般來說，人們關心的是擴增子的量。而real time PCR 主要利用的是擴增曲線（amplification curve）, 循環(huán)數(shù)；擴增子長度，擴增效率，擴增子多少，也加以考慮。珠?？焖賟PCR儀設置TaqMan方法通過采用熒光探針在PCR循環(huán)過程中隨著特定PCR產物的累計而對其進行檢測。
原理：在DNA擴增反應中，通過熒光化學物質測定每次PCR循環(huán)后產物總量。目的：實現(xiàn)定量而不止是定性分析。通過與內參基因進行對比，對樣品中的特定基因進行相對表達量的計算，以實現(xiàn)定量分析。qPCR的檢測方法有兩種，SYBRGreenl法和TaqMan探針法，下面介紹常用的SYBRGreenl法。原理：在PCR反應體系中，加入過量SYBR熒光染料，使其特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產物的增加完全同步。試劑及儀器：Hieff®QpcrSYBR®GreenMasterMix試劑(翌圣)和ABI7500Real-TimeSystem實時熒光定量PCR儀進行qRT-PCR擴增。
雙雜交探針是兩個特異性探針，一個只5’端標記熒光基團，另一個只3’端標記猝滅基團。這兩個探針序列和模板特異性結合，結合的位置非常鄰近。在qPCR反應的退火階段，當兩個探針與模板結合時，位于兩個探針頭尾的熒光基團之間產生FRET現(xiàn)象，促進受體的熒光基團釋放一種波長的熒光信號，從而達到實時監(jiān)控反應進程的目的。Amplifluor系統(tǒng)包括兩個特異性引物和一條檢測探針（UniPrimer），其中一條引物的5’末端帶有部分序列和UniPrimer的3’末端部分序列相同。UniPrimer兩端分別被熒光和淬滅基團標記且有發(fā)卡結構。反應時，UniPrimer結合到特異性引物擴增出的模板上作為引物進行PCR反應，在延伸的過程中UniPrimer發(fā)夾結構打開，熒光信號釋放。蝎形引物為莖環(huán)結構，其5’端帶有一個熒光基團FAM，3’端帶有一個淬滅基團DABCYL，其環(huán)的部分序列和模板完全互補配對。體系有模板時，莖環(huán)結構穩(wěn)定，熒光和淬滅基團相距近，不能檢出熒光信號；體系無模板時，蝎形引物和模板特異性結合并起始PCR擴增，蝎形引物的環(huán)結構與擴增出的模板互補雜交，導致莖環(huán)結構被破壞，釋放出大量的熒光信號，熒光儀器可以實時收集這些熒光信號并生成相應的熒光擴增曲線。dPCR比qPCR準確度與精密度高。
交聯(lián)和裂解——穩(wěn)定復合物并分離核組分:第一步對時間要求嚴格并且需要優(yōu)化。體內共價交聯(lián)穩(wěn)定蛋白質-DNA相互作用并于特定時間點進行分析。通常采用甲醛交聯(lián)，加入甘氨酸以終止反應。交聯(lián)劑滲透到完整細胞中并將蛋白質-DNA復合物鎖定在一起從而進行分析。交聯(lián)劑在整個過程中保持復合物穩(wěn)定，但其作用必須是可逆的才能用于ChIP。一些非常穩(wěn)定的蛋白質-DNA相互作用則不需要交聯(lián)。接下來，使用裂解液透化細胞膜，釋放細胞組分，然后蛋白質-DNA復合物變得可溶。去除細胞溶質蛋白以減少背景信號并增加靈敏度。注意：此時可以停止ChIP測定。 經過交聯(lián)，淬滅和洗滌細胞沉淀后，將裂解物于-80℃儲存。自聚合酶鏈式反應技術被發(fā)明以來，其簡單、可靠、快速、靈敏的質量，PCR是分子生物學中使用的技術。深圳酷博qPCR儀應用
Quantagene q225 系列熒光定量PCR 系統(tǒng)：快速 分秒必爭，43 分鐘完成40 循環(huán)qPCR 實驗。珠?？焖賟PCR儀設置
TaqMan 方法的優(yōu)點：需要在探針和目標分子（靶點）之間發(fā)生特異性的水解（雜交），方可生成熒光信號?？墒褂妹黠@不同的報告基因染料標記探針，在一個反應管內擴增并檢測兩個不同的序列。無需PCR后處理，減少分析工作量并節(jié)省材料成本。TaqMan方法的缺點：TaqMan方法的主要缺點在于需要根據(jù)不同的序列，合成不同的探針。SYBR Green I染料試劑。一般將可與雙鏈DNA發(fā)生結合的小分子分為以下兩類：嵌入劑、小溝結合物。無論哪種結合方法，用于PCR實時檢測的DNA結合染料都需要滿足以下兩個條件：結合至雙鏈DNA時，會有增強的熒光對 PCR 不會產生抑制我們開發(fā)更加優(yōu)化的條件，使得SYBR Green I染料的使用不會對PCR產生抑制并帶來相對于溴化乙錠更為靈敏的檢測。珠海快速qPCR儀設置
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