CTNT免疫熒光

熒光素標(biāo)記抗體的方法：方法及步驟：①抗體的準(zhǔn)備：取適量已知球蛋白濃度之溶液，置入三角燒瓶中，加入生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使然后蛋白濃度為20mg/ml，緩沖液容量為總量的1/10，混勻，將三角燒瓶置冰槽中，電磁攪拌（速度適當(dāng)以不起泡沫為宜）5～10min。②熒光素的準(zhǔn)備：根據(jù)欲標(biāo)記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克蛋白加0.01mg熒光素，用分析天平準(zhǔn)確稱所取所需的異硫氰酸熒光素粉末。③結(jié)合（或稱標(biāo)記）：邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于三角燒瓶壁或攪拌玻棒上（大約5～10min內(nèi)加完），加畢后，繼續(xù)攪拌12～18h。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故須及時(shí)添冰去水；亦可將結(jié)合裝置安放在4℃冰箱或冰庫(kù)中。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞內(nèi)分子的相互作用。CTNT免疫熒光

檢測(cè)復(fù)雜的生物學(xué)結(jié)構(gòu)需要較高清晰度的熒光信號(hào)，并將熒光信號(hào)從背景噪聲中分離開(kāi)來(lái)。標(biāo)準(zhǔn)的免疫熒光標(biāo)記很少能夠獲得較佳信噪比的成像效果。獲得良好圖片和較佳的可供發(fā)表的高質(zhì)量圖像之間的差異就在于：需要精細(xì)調(diào)整樣品信號(hào)達(dá)到峰值特異性、高清晰度和較佳放大倍數(shù)。雖然熒光基團(tuán)是進(jìn)行高質(zhì)量細(xì)胞成像的較佳選擇，但不可避免地也極易發(fā)生光漂白，即熒光信號(hào)的光化學(xué)降解或衰退。任何光敏感度的下降都可能導(dǎo)致數(shù)據(jù)出現(xiàn)偏差，產(chǎn)生假性結(jié)果?？勾銣绶馄瑒┛梢员Ｗo(hù)熒光標(biāo)記蛋白的穩(wěn)定性，維持?jǐn)?shù)周乃至數(shù)月的圖像信號(hào)完整度。ALBUMIN免疫熒光染色免疫熒光技術(shù)在免疫學(xué)研究中發(fā)揮重要作用，幫助揭示細(xì)胞和分子的功能和相互關(guān)系。

免疫熒光注意事項(xiàng)：對(duì)照實(shí)驗(yàn)的設(shè)置：1、內(nèi)源性組織背景對(duì)照：某些細(xì)胞和組織可能有固有的生物學(xué)性質(zhì)，會(huì)產(chǎn)生背景熒光，對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響，例如色素脂褐質(zhì)。因此在孵育一抗前，應(yīng)對(duì)樣品進(jìn)行觀察，確?？乖旧頉](méi)有信號(hào)。2、陽(yáng)性對(duì)照：用確認(rèn)含有待測(cè)抗原的組織或細(xì)胞，與待測(cè)標(biāo)本進(jìn)行統(tǒng)一處理，結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，可證明待測(cè)抗原有一定活性并且實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用的試劑及方法均可靠。3、陰性對(duì)照：與陽(yáng)性對(duì)照相反，用明確不含有待測(cè)抗原的細(xì)胞或組織切片染色，結(jié)果若為陰性，可排除染色過(guò)程中由于非特異性染色造成的假陽(yáng)性結(jié)果。

細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過(guò)的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來(lái)回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來(lái)。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒(méi)有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過(guò)夜，也可37度2小時(shí)，感覺(jué)前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽?shù)脂那樣會(huì)干，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。免疫熒光技術(shù)通過(guò)熒光信號(hào)的觀察來(lái)確定抗原或抗體的分布和定位。

細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)注意事項(xiàng)：根據(jù)所檢測(cè)抗原所在位置來(lái)確認(rèn)是否需要加入 Triton 進(jìn)行通透。若所檢測(cè)抗原表位位于膜蛋白的白外段，則不需要通透；一般 5% BSA 封閉即可達(dá)到效果；從加熒光二抗起，后面所有操作步驟盡量避光?？s短在熒光顯微鏡下的觀察時(shí)間，1~2 h 為宜。染色后盡快熒光顯微鏡下觀察，若不能可放入 4 ℃ 冰箱避光保存一周。無(wú)/弱染色：烤片溫度過(guò)高，推薦 56~60 ℃ 1~2 h；一抗是否適用固定液和石蠟切片，使用濃度是否過(guò)低，孵育是否時(shí)間過(guò)短等。免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。ALBUMIN免疫熒光染色

免疫熒光技術(shù)可以用于研究藥物的靶點(diǎn)和作用機(jī)制。CTNT免疫熒光

免疫熒光技術(shù)又稱熒光抗體技術(shù)，是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。很早以來(lái)就有一些學(xué)者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結(jié)合，利用抗原抗體反應(yīng)進(jìn)行組織或細(xì)胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術(shù)是標(biāo)記免疫技術(shù)中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學(xué)、生物化學(xué)和顯微鏡技術(shù)的基礎(chǔ)上建立起來(lái)的一項(xiàng)技術(shù)。Coons等于1941年初次采用熒光素進(jìn)行標(biāo)記抗體獲得成功。經(jīng)過(guò)幾十年的發(fā)展，該技術(shù)已相當(dāng)成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標(biāo)記物示蹤或檢查相應(yīng)抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術(shù)。在實(shí)際工作中熒光抗原技術(shù)很少應(yīng)用，所以人們習(xí)慣將熒光抗體技術(shù)稱為免疫熒光技術(shù)CTNT免疫熒光

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