單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組關(guān)鍵步驟：單細(xì)胞的分離和捕獲：溫和分離，稀有細(xì)胞。轉(zhuǎn)錄本的捕獲和擴(kuò)增：RNA測序需要0.1-1.0ug total RNA，捕獲效率10%（5-**NA測序需要1ng DNA，極限稀釋加移液分離單細(xì)胞；顯微操作分選單細(xì)胞；流式分選帶有表面Marker的單細(xì)胞；激光切割實(shí)體組織；微流控技術(shù)；磁珠捕獲，主要用于CTC。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)基本概念：普通轉(zhuǎn)錄組的思路也可以應(yīng)用到單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組。普通轉(zhuǎn)錄組相當(dāng)于把一群細(xì)胞混合到一起去提取RNA，獲得的是每個細(xì)胞中RNA表達(dá)量的平均值。單細(xì)胞是把每個細(xì)胞單獨(dú)分出來去提取RNA，然后建庫測序，獲得是是單個細(xì)胞的表達(dá)值。在每個細(xì)胞里面基因的表達(dá)具有隨機(jī)性，且存在異質(zhì)性?；诟咄繙y序平臺的轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序技術(shù)能夠全方面獲得物種特定組織的轉(zhuǎn)錄本信息。河南高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)定性分析
轉(zhuǎn)錄組學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域：農(nóng)林領(lǐng)域：生長發(fā)育機(jī)制，抗逆脅迫機(jī)制，育種，物種保護(hù)研究等；畜牧業(yè)：生長發(fā)育機(jī)制，致病機(jī)理研究，肉類及乳制品品質(zhì)研究等；海洋水產(chǎn)：生長發(fā)育機(jī)制，漁業(yè)資源，漁業(yè)環(huán)境與水產(chǎn)品安全等；微生物：致病機(jī)理，耐藥機(jī)制，病原體-宿主相互作用研究等；生物醫(yī)藥：生物標(biāo)志物，疾病機(jī)理機(jī)制，疾病分型，藥物開發(fā)，個性化醫(yī)治等；環(huán)境科學(xué)：發(fā)酵過程優(yōu)化，生物燃料生產(chǎn)，環(huán)境危害風(fēng)險評估研究等；食品科學(xué)：食品儲藏及加工條件優(yōu)化，食品組分及品質(zhì)鑒定，功能性食品開發(fā)，食品安全監(jiān)檢測等。濟(jì)南宏轉(zhuǎn)錄學(xué)組轉(zhuǎn)錄組學(xué)有高通量、更精確的數(shù)字信號。
轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序流程：1、樣品RNA準(zhǔn)備。2、測序文庫構(gòu)建。3、DNA成簇(Cluster)擴(kuò)增。4、高通量測序(Illumina)。5、數(shù)據(jù)分析。轉(zhuǎn)錄組的分析大致有以下幾種情況：1、同一物種在發(fā)育過程中的各時間節(jié)點(diǎn)的基因表達(dá)特點(diǎn)及存在的差異；2、不同品系之間存在的差異表達(dá)基因；3、不同的外界條件處理，如細(xì)菌、病毒、光照、紫外、干旱、高溫、高鹽脅迫，對基因表達(dá)的影響；4、同一個體，不同組織之間的基因表達(dá)差異。簡而言之，轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達(dá)的情況。
轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序比其他研究方法有哪些優(yōu)勢?轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序具有以下優(yōu)勢：（1）可以直接測定每個轉(zhuǎn)錄本片段序列、單核苷酸分辨率的準(zhǔn)確度，同時不存在傳統(tǒng)微陣列雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應(yīng)和背景噪音問題；（2）靈敏度高，可以檢測細(xì)胞中少至幾個拷貝的稀有轉(zhuǎn)錄本；（3）可以對任意物種進(jìn)行全基因組分析，無需預(yù)先設(shè)計特異性探針，因此無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，同時能夠檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本，并準(zhǔn)確地識別可變剪切位點(diǎn)及cSNP，UTR區(qū)域。（4）檢測范圍廣，高于6個數(shù)量級的動態(tài)檢測范圍，能夠同時鑒定和定量稀有轉(zhuǎn)錄本和正常轉(zhuǎn)錄本。轉(zhuǎn)錄學(xué)組測序可對任意物種的整體轉(zhuǎn)錄活動進(jìn)行檢測。
circRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)：是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，沒有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′poly（A）結(jié)構(gòu)，主要位于細(xì)胞質(zhì)或儲存于外泌體中，不受RNA外切酶影響，表達(dá)更穩(wěn)定且不易降解，已被證明普遍存在于多種真核生物體內(nèi)[1]。大多數(shù)circRNA是由外顯子環(huán)化而成，也有部分circRNA是由內(nèi)含子環(huán)化而成的套索結(jié)構(gòu)。同時由于circRNA含有大量的miRNA應(yīng)答原件（MREs），能與AGO蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的催化關(guān)鍵，然后導(dǎo)致circRNA降解。根據(jù)來源，circRNA可大致分為四類：全外顯子型的circRNA，內(nèi)含子和外顯子組合的EIcircRNA，內(nèi)含子組成的套索型ciRNA，由病毒RNA基因組、tRNA、rRNA、snRNA等環(huán)化產(chǎn)生的circRNA。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可應(yīng)用于疾病標(biāo)志物篩查、疾病的診斷和分型、疾病復(fù)發(fā)診斷。河南高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)定性分析
轉(zhuǎn)錄組學(xué)無需了解物種基因信息，能夠直接對任何物種進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析。河南高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)定性分析
單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)：Anydeplete技術(shù)首先通過隨機(jī)引物進(jìn)行一鏈合成，一鏈合成引入核苷酸類似物，用于酶切打斷，二鏈合成同樣引入核苷酸類似物用于保證鏈特異性。然后兩端加上接頭，接頭一條鏈也帶有核苷酸類似物，用于酶切降解。當(dāng)形成單鏈文庫后，設(shè)計特異性引物與rRNA形成文庫結(jié)合，一輪退火延伸，rRNA文庫形成雙鏈結(jié)構(gòu)。Reverseadaptor上帶有特異的酶切位點(diǎn)，當(dāng)形成雙鏈結(jié)構(gòu)酶切位點(diǎn)被識別，切去接頭，這樣rRNA形成的文庫不帶有完整的接頭，而其他文庫帶有完整接頭，通過PCR擴(kuò)增富積既能得到想要的信息，包含mRNA及LncRNA信息。同樣Anydeplete技術(shù)與10×genomics技術(shù)一樣，包含分子標(biāo)簽，可分析duplication及PCR產(chǎn)生突變位點(diǎn)。河南高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)定性分析