宏轉(zhuǎn)錄學(xué)組技術(shù)分析

轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序結(jié)果的影響因素？RNA的降解嚴(yán)重影響測序的質(zhì)量，RNA降解后，加入poly-A后無法捕獲純化mRNA，因此，隨機引物反轉(zhuǎn)錄無法得到全部的cDNA，導(dǎo)致測序結(jié)果出現(xiàn)明顯的3‘-和5’-偏向。文庫中的poly-A多聚物的存在會對測序信號產(chǎn)生干擾，影響測序結(jié)果的準(zhǔn)確性；同時由于轉(zhuǎn)錄組中轉(zhuǎn)錄本的豐度不一致，實驗前需要對樣本進行均一化處理，否則高豐度的表達基因會掩蓋低豐度表達基因，導(dǎo)致尋找新基因失敗或者是獲得大量無意義的重復(fù)序列。轉(zhuǎn)錄組學(xué)是從RNA水平研究基因表達的情況。宏轉(zhuǎn)錄學(xué)組技術(shù)分析

全轉(zhuǎn)錄組測序為什么需要構(gòu)建兩個文庫？全轉(zhuǎn)錄組測序需要構(gòu)建2個測序文庫，一個小RNA文庫和一個去除核糖體RNA的鏈特異性文庫，然后分別上機測序。小RNA長度較短，一般小于50nt，采用測序策略為50SE。其他三類RNA序列一般大于200，通常在1000以上，可達幾萬，通過片段化構(gòu)建150PE測序文庫。然后小RNA文庫可以獲得miRNA序列信息，去核糖體的鏈特異性文庫可以獲得mRNA、lncRNA和circRNA的序列信息。轉(zhuǎn)錄組學(xué)即特定細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄出來的所有RNA的總和，包括mRNA和非編碼RNA。河南SmalIRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)鑒定轉(zhuǎn)錄組學(xué)廣義上指在某一生理條件下，細(xì)胞內(nèi)所有轉(zhuǎn)錄組產(chǎn)物的組合。

宏轉(zhuǎn)錄學(xué)組的概念：宏轉(zhuǎn)錄組是特定時期、環(huán)境樣本、組織樣本中所有的微生物的RNA（轉(zhuǎn)錄本）的匯合。通過對這些轉(zhuǎn)錄本進行大規(guī)模高通量測序，可以直接獲得環(huán)境中可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)的微生物轉(zhuǎn)錄組信息。這種技術(shù)不只具有宏基因組技術(shù)的全部優(yōu)點，可以檢測環(huán)境中的活性微生物、活性轉(zhuǎn)錄本以及活性功能進行研究，還可以比較不同環(huán)境下的差異表達基因和差異功能途徑，揭示微生物在不同環(huán)境壓力下的適應(yīng)機制，探索環(huán)境與微生物之間的互作機理。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)，基因組學(xué)，蛋白質(zhì)組學(xué)的區(qū)別：蛋白組學(xué)針對的是全體蛋白，組要以2D-Gel和質(zhì)譜為主，分為top-down和bottom-up分析方法。理念和基因組類似，將蛋白用特定的物料化學(xué)手段分解成小肽段，在通過質(zhì)量反推蛋白序列，之后進行搜索，標(biāo)識已知未知的蛋白序列。轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的是某個時間點的mRNA總和，可以用芯片，也可以用測序。芯片是用已知的基因探針，測序則有可能發(fā)現(xiàn)新的mRNA?；蚪M學(xué)研究的主要是基因組DNA，使用方法目前以二代測序為主，將基因組拆成小片段后再用生物信息學(xué)算法進行迭代組裝。當(dāng)然這只是第1步，隨后還有繁瑣的基因注釋等數(shù)據(jù)分析工作。轉(zhuǎn)錄組學(xué)能夠檢測未知基因，發(fā)現(xiàn)新的轉(zhuǎn)錄本。

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)：單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組目前主要有三種方法：SMART擴增技術(shù)、10×genomics技術(shù)及Andeplete技術(shù)。SMART擴增技術(shù)比較關(guān)鍵的技術(shù)，就是設(shè)計了2個特殊的引物。再配合用MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶進行逆轉(zhuǎn)錄。特殊引物1由中間PolyT序列加上一段通用序列及3’末端兩個簡并堿基構(gòu)成，但在PolyT的3’端倒數(shù)第二個堿基是A、C、G而非T的簡并堿基，而倒數(shù)第1個為簡并堿基，這樣做的好處是讓它正好結(jié)合在mRNA的3’端連到Poly(A)尾巴的這個連接處，而不會結(jié)合到mRNA的別的地方。這樣就保證了逆轉(zhuǎn)錄的起始位置正好是mRNA的3’端的序列終止位置。MMLV逆轉(zhuǎn)錄酶，這個酶有個特點，就是它在轉(zhuǎn)錄到mRNA的5’端末端的時侯，會在新合成的cDNA的3’末端，多加出幾個C堿基來。轉(zhuǎn)錄組學(xué)可以直接測定每個轉(zhuǎn)錄本單核苷酸分辨率的準(zhǔn)確度。濟南RNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)主要技術(shù)

RNA-Seq轉(zhuǎn)錄組學(xué)有著巨大的應(yīng)用前景。宏轉(zhuǎn)錄學(xué)組技術(shù)分析

circRNA轉(zhuǎn)錄組學(xué)：是一類具有閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的非編碼RNA分子，沒有5′帽子結(jié)構(gòu)和3′poly（A）結(jié)構(gòu)，主要位于細(xì)胞質(zhì)或儲存于外泌體中，不受RNA外切酶影響，表達更穩(wěn)定且不易降解，已被證明普遍存在于多種真核生物體內(nèi)[1]。大多數(shù)circRNA是由外顯子環(huán)化而成，也有部分circRNA是由內(nèi)含子環(huán)化而成的套索結(jié)構(gòu)。同時由于circRNA含有大量的miRNA應(yīng)答原件（MREs），能與AGO蛋白形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體（RISC）的催化關(guān)鍵，然后導(dǎo)致circRNA降解。根據(jù)來源，circRNA可大致分為四類：全外顯子型的circRNA，內(nèi)含子和外顯子組合的EIcircRNA，內(nèi)含子組成的套索型ciRNA，由病毒RNA基因組、tRNA、rRNA、snRNA等環(huán)化產(chǎn)生的circRNA。宏轉(zhuǎn)錄學(xué)組技術(shù)分析

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