上海丙二?；揎椀鞍踪|(zhì)組學一般流程

蛋白磷酸化檢測方法：一、Western Blot檢測方法優(yōu)勢：1. WB方法簡便，多數(shù)實驗室具備Western Blot設備條件。2. 許多磷酸化抗體十分靈敏，能夠檢測低至10ug的蛋白樣品。3. 對于豐度低的蛋白，可以先通過IP使用目標蛋白的抗體對目標蛋白進行富集，再進行WB檢測被磷酸化的蛋白，檢測效率可以提高幾倍甚至幾十倍。二、質(zhì)譜檢測方法：Western Blot的方法雖然簡便，但是對于大規(guī)模分析復雜的生物樣品的磷酸化水平就不再適用了。而質(zhì)譜卻能很好的解決這一問題。依靠高準確度質(zhì)譜儀，如今快速準確分析細胞中高豐度蛋白的磷酸化修飾已是非常簡單的事。具體的檢測方法為先通過SDS-PAGE膠，或者2D-PAGE膠等分離目標蛋白，將含有目標蛋白的條帶切下，胰酶消化，LC-MS/MS檢測分析蛋白序列和相應位點的磷酸化修飾。這個方法適用于同時檢測多個目標蛋白的磷酸化水平。目前對乙酰化修飾的功能研究主要集中在對細胞轉(zhuǎn)錄調(diào)控，以及對代謝通路的調(diào)控這兩個方面。上海丙二?；揎椀鞍踪|(zhì)組學一般流程

蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學：磷酸化蛋白質(zhì)是由蛋白激酶將ATP或GTP分子上的磷酸基團轉(zhuǎn)移到底物蛋白特定的氨基酸側(cè)鏈上形成的。蛋白質(zhì)磷酸化是一種可逆的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。在哺乳動物的細胞生命周期中，至少有三分之一的蛋白質(zhì)發(fā)生磷酸化修飾。磷酸化修飾參與許多信號轉(zhuǎn)導途徑和細胞代謝過程，且許多已知的疾病也與蛋白質(zhì)的異常磷酸化有關。因此，對磷酸化蛋白質(zhì)組進行定量研究，尋找差異表達的磷酸化蛋白質(zhì)，有助于發(fā)現(xiàn)疾病的生物標志物和尋找新的具有診療潛力的藥物靶標。杭州蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椊M學研究蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學具有探索性。

蛋白質(zhì)翻譯后修飾組學：血漿蛋白糖基化修飾分析：蛋白質(zhì)糖基化指碳水化合物通過共翻譯或翻譯后修飾的方式附著到蛋白質(zhì)上的過程，是一種常見的蛋白質(zhì)翻譯后修飾。分泌的細胞外蛋白常被糖基化，糖基化蛋白通常是重要的整合膜蛋白。血漿中的蛋白質(zhì)包括維持機體正常生理狀態(tài)的蛋白質(zhì)和機體分泌、滲漏、脫落的蛋白質(zhì)，其中不乏存在一些糖基化蛋白質(zhì)。而蛋白質(zhì)糖基化修飾不只影響蛋白質(zhì)的空間構象、生物活性、運輸和定位，而且在分子識別、細胞通信、信號轉(zhuǎn)導等特定生物過程中發(fā)揮著至關重要的作用。因此對血漿蛋白糖基化進行分析，有助于研究血漿蛋白的生理功能等。

蛋白質(zhì)磷酸化修飾組學：蛋白質(zhì)的磷酸化修飾是生物體內(nèi)重要的共價修飾方式之一。磷酸化修飾本身所具有的簡單、靈活、可逆的特性，以及磷酸基團的供體ATP的易得性，使得磷酸化修飾被真核細胞所選擇接受成為一種比較普遍的調(diào)控手段。蛋白質(zhì)的磷酸化和去磷酸化這一可逆過程，幾乎調(diào)節(jié)著包括細胞的增殖、發(fā)育、分化、細胞骨架調(diào)控、細胞凋亡、神經(jīng)活動、肌肉收縮、新陳代謝發(fā)生等生命活動的所有過程，并且可逆的蛋白質(zhì)磷酸化是目前所知道的比較主要的信號轉(zhuǎn)導方式。目前已經(jīng)知道有許多人類疾病是由于異常的磷酸化修飾所引起，而有些磷酸化修飾卻是某種疾病所導致的后果。乙?；揎検求w內(nèi)高度保守的可逆轉(zhuǎn)的蛋白修飾。

蛋白質(zhì)學組翻譯后修飾自下而上分析策略：常用的糖蛋白分離和富集技術有：a. 凝集素親和技術；b. 肼化學富集；c. 親水性相互作用色譜法；d. β-消除/邁克爾加成反應?；谫|(zhì)譜的糖蛋白鑒定和糖基化位點測定方法有：a. PNGase F酶法；b. Endo H酶法；c. 三氟甲烷磺酸(TFMS)法。泛素化：泛素是一種由76個氨基酸組成的多肽，在真核生物中高度保守，可通過異肽鍵與目標蛋白賴氨酸殘基的氨基進行共價連接。泛素化蛋白的富集主要基于標記，泛素用親和標簽（通常為6xHis）進行標記，并通過鎳螯合色譜親和提取泛素化蛋白。由于泛素的C端為Arg-Gly-Gly結構，經(jīng)胰蛋白酶水解后，Gly-Gly保留在修飾蛋白的肽鏈上，使肽的質(zhì)量增加114，因此可作為泛素定位位點的質(zhì)量標記。用HPLC對樣品進行預分離，使用針對特定殘留結構的抗體富集泛素化肽，可很大程度上提高泛素化蛋白的濃度。串聯(lián)質(zhì)譜可以鑒定泛素化位點。蛋白質(zhì)修飾可檢測修飾類型有磷酸化、糖基化、乙?；?、泛素化、丙?；⒍□；?、丙二酰化。杭州蛋白質(zhì)棕櫚?；揎椊M學研究

泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位。上海丙二?；揎椀鞍踪|(zhì)組學一般流程

蛋白質(zhì)乙酰化修飾組學技術：乙?；揎検求w內(nèi)高度保守的可逆轉(zhuǎn)的蛋白修飾，對細胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的刺激有著非常重要的作用。此外，還存在大量的非組蛋白乙?；揎梾⑴c了代謝通路及代謝酶活性的調(diào)節(jié)。乙?；揎椊M學技術服務采用肽段預分離降低高豐度組蛋白對蛋白乙?；b定的影響，再結合免疫共沉淀通過高效的抗體富集乙酰化的肽段，從而實現(xiàn)大規(guī)模乙?；蔫b定及定量。蛋白質(zhì)泛素化修飾組學技術：泛素化修飾是一種重要的翻譯后修飾。泛素-蛋白酶體系統(tǒng)介導了真核生物體內(nèi)80%~85%的蛋白質(zhì)降解。此外，泛素化修飾還可以直接影響蛋白質(zhì)的活性和定位，調(diào)控包括細胞周期、細胞凋亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA 損傷修復以及免疫應答等在內(nèi)的多種細胞活動。上海丙二?；揎椀鞍踪|(zhì)組學一般流程

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