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來源: 發(fā)布時間:2025-08-31

準(zhǔn)備碎冰和。把膜置于甲醇溶液中活化1分鐘,然后轉(zhuǎn)移至轉(zhuǎn)膜液中平衡3分鐘后備用。2、轉(zhuǎn)膜組裝轉(zhuǎn)膜三明治夾,這一步很關(guān)鍵,重要的是膠和膜之間不能有氣泡且膜與膠要保證貼合緊密(否則會翻車),可以加多點(diǎn)轉(zhuǎn)膜液泡著。組裝好后加滿轉(zhuǎn)膜液,設(shè)置電源參數(shù),我習(xí)慣恒流轉(zhuǎn)膜,200-280毫安,1-2小時,根據(jù)分子量定,如50KD的分子用60分鐘就夠了。如果一個電源帶兩個轉(zhuǎn)膜大槽即四塊膠,我就會用恒壓70-110V。這個過程重要的是做好降溫。這里簡單說一下蛋白分子量與玻璃板厚度,分離膠的濃度,轉(zhuǎn)膜電源參數(shù)的選擇問題。如果是能用1毫米的玻璃板就不用,因?yàn)檗D(zhuǎn)膜是在電場的作用下蛋白分子從膠上遷移到膜上,1毫米膠的蛋白遷移距離要比。選擇更薄的膠蛋白轉(zhuǎn)膜時間可以減少,從而減少發(fā)熱,以免膠變形,條帶也會更好看。然后是分離膠的濃度,如果是150—200KD的分子選10%以下的的分離膠,200—300KD的選8%的,300KD以上的選6%的,小于30KD的200mA30分鐘,30-100KD的按分子量的數(shù)值算,如70KD,250mA70分鐘;100-150KD的250mA100分鐘;150—300KD的分子轉(zhuǎn)膜條件用280毫安(以上均是對于,),120分鐘足矣,前提是膠的濃度相適應(yīng)。五、封閉孵一抗1、封閉轉(zhuǎn)膜結(jié)束后。干貨分享 | PCR反應(yīng)污染原因追蹤及污染處理方法。哪里有科研技術(shù)服務(wù)實(shí)驗(yàn)室

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一種是用beta巰基乙醇打開蛋白質(zhì)分子二硫鍵的,另一種是用DTT(二硫蘇糖醇)。兩者的作用是一樣的,但特點(diǎn)不一樣,前者更容易與氧氣反應(yīng),穩(wěn)定性比后者差,如果在常溫下暴露在空中,前者只能維持24小時的活性,后者卻可以維持7天左右。所以該如何選擇?如果是蛋白樣品較少,跑幾次就可以用完的樣品,這時選擇beta巰基乙醇。如果樣品很多,計劃跑上幾十次的,優(yōu)先選擇DTT,建議變性后分裝保存。二、SDS-PAGE凝膠配制1、配膠前準(zhǔn)備首先強(qiáng)調(diào)一下,一塊好的膠是跑好蛋白的前提,所以這個環(huán)節(jié)也不容忽視。玻璃板的選擇,一種是1毫米厚度的,另一種是,這個厚度選擇也是有講究的,如果上樣體積小于10微升,優(yōu)先選1毫米,否則選。原因是什么?答案在轉(zhuǎn)膜部分揭曉。還有分離膠的濃度也要選擇適合的。然后玻璃板和梳子要洗干凈,晾干。裝板,注意厚板和薄板的底部要對齊,否則會漏膠。加制膠的各成分前,要觀察液體是否有沉淀,有沉淀的盡量不要用。2、制膠按配方說明依次加入各組分,加完SDS后先簡單手動搖勻幾下,然后迅速加入過硫酸銨和TEMED,搖勻,緊接著就灌膠。然后我習(xí)慣用95%的酒精壓膠,我也用過純水,感覺純水壓沒那么好,由于水的密度較大,會把分界處的膠壓得膨大。

首先,預(yù)實(shí)驗(yàn)必須要當(dāng)做正式實(shí)驗(yàn)來對待(態(tài)度要放端正,這是必須的)。預(yù)實(shí)驗(yàn)的每一步都需要詳細(xì)規(guī)劃,多方籌謀。不論是實(shí)驗(yàn)動物的選擇,還是檢測試劑的購買,都盡量和正式實(shí)驗(yàn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。建議大家先把所有試劑和藥物購買完畢后,再去購買實(shí)驗(yàn)動物。因?yàn)閯游飼L胖,長胖后給藥劑量就要增加,不僅多花錢,并且還容易影響實(shí)驗(yàn)效果。筆者曾經(jīng)提前將實(shí)驗(yàn)動物買回,但因?yàn)樘厥庠驔]能購買到造模藥物,**終只能忍痛割愛將動物贈送他人,白白虧了一筆血汗錢(那批老鼠在我這兒白吃白喝長得太胖,沒辦法用作造模)。動物及試劑購買首先需要考慮:實(shí)驗(yàn)動物品種、體重、性別、周齡(通常根據(jù)既往文獻(xiàn)報道可以獲得答案)、數(shù)量(需要考慮到實(shí)驗(yàn)有一定動物死亡率或者動物本身會打架互毆,因此需要提前購買足夠的動物)。動物購買的途徑、安置的地點(diǎn),飲食管理(一般實(shí)驗(yàn)室會有動物房,也可以從其他地方購買),動物免疫證明、倫理證明需要提前準(zhǔn)備好。實(shí)驗(yàn)相關(guān)的試劑和藥物:比如造模藥物和器械,動物干預(yù)所需藥物,陽***物選擇及購買(有些藥物購買很困難,必須通過特殊程序才能買到)。如果涉及到有創(chuàng)操作,要提前準(zhǔn)備好**物(***建議提前購買),手術(shù)器械。了解更多關(guān)于動物模型的問題歡迎來電咨詢,如您需要,竭誠為您服務(wù)。

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